На Вашето внимание- две актуални научни статии, свързани с лекарствените гъби.

Медицински свойства на веществата в гъбите висши базидиомицети: актуални перспективи (преглед)

Solomon P. Wasser и Alexander L. Weis

Резюме: Този преглед разглежда някои от наскоро изолираните и идентифицирани вещества с произход от гъбите висши базидиомицети, които показват обещаващи анти-туморно, имуномодулиращо, кардиоваскуларн и анти-хиперхолестеролемно, анти-вирусно, анти-бактериално, анти-паразитно, хепатозащитно и анти-диабетно действие. Медицинските гъби имат дълга история на използване в народната медицина. В Китай, Русия, Япония и Корея, както и САЩ и Канада, са известни гъби, използвани срещу рак на стомаха, хранопровода, белите дробове, и др. Съществуват приблизително двеста сорта гъби, които доказано забавят растежа на различни видове тумори. Повечето от анти-туморните вещества в гъбите, обаче, не са ясно определени. От медицинските гъби са изолирани някои анти-туморни полизахариди, например хетеро-b-глюкани и техните протеинови комплекси (например ксилоглюкани и киселинни b-глюкани, съдържащи уронова киселина), както и диетични фибри, лектини и терпеноиди. В Япония, Русия, Китай и САЩ от плодните тела, мицели и мицелни култури на различни медицински гъби (Lentinus edodes (Шиитаке), Ganoderma lucidum (Рейши), Schizophyllum commune (Шизофилум), Trametes versicolor (Траметес), Inonotus obliquus (Инонотус) и Flaminulina velutipes (Фламинулина) са разработени няколко различни полизахаридни анти-туморни агенти. Клетъчните компоненти, както и вторичните метаболити на голям брой гъби, оказват ефект върху имунната система на приемника, и следователно могат да се използват за лечение на различни болестни състояния. Информацията, представена в този преглед, е полезна за изследване и разбиране на богатите традиции на медицинските гъби в източните и западните култури и медицина. Ключови думи: диетични фибри, висши базидиомицети, имуномодулиращ ефект, имуностмулатори, лектини, медицински гъби, полизахариди, терпеноиди, анти-туморни вещества Съкращения: BRM: модификатор на биологичния отговор; BSC: холестерол в кръвния серум; HMGCoA редуктаза: 3-хидрокси-3-метил-глутарил-коензим А редуктаза; i.p.: интраперитонеален метод; p.o.: орален метод; VLDL: липопротеини с ниска плътност Въведение Гъбите висши базидиомицети са били използвани в народната медицина от древни времена. Висшите базидиомицети (ядливи и отровни гъби) не са таксономична група. Те включват сортове от клас Basidiomycetes, които имат макроскопични плодни тела (базидиома или базидиокарп), които могат да бъдат хипогенни или епигенни, достатъчно големи да се видят с просто око, и обикновено събирани на ръка. Висшите базидиомицети биват приблизително 10 000 сорта от 550 рода и 80 фамилии. Диагностичният характер на базидиомицетите е наличието на базидиоспори, раждащи базидиум. Типичен базидиум на по-високи базидиомицети е септен и има четири едноклетъчни хиалина или оцветени хаплоидни базидиоспори (балисто- или статисмоспори), разпространявани основно по въздуха. Типичният цикъл на живот включва поникване на базидиоспората, за да даде септен първичен (хаплоиден) мицел. По-късно, по време на диплоидизациите, хомо- и хетероталичният първичен мицел става вторичен (дикариотен) мицел, който често има кламп връзки. Преди развитието на базидиоспора има сливане на ядрото в младия базидиум и мейоза. Характерната макроскопична базидиома обикновено е месеста и приема различни форми. Характерните черти на по-високите базидиомицети ги разделят на земни или хипогенни, дървесни или сапрофитни, микоризни или патогенни, както и ядливи, медицински, халюциногенни и отровни гъби. Медицинските гъби, използвани срещу рак, са познати в Китай, Русия, Япония и Корея, както и в САЩ и Канада. В руската медицина екстракт от Chaga (Inonotus obliquus) се използва като анти-туморно лекарство и диуретик. А. Солженицин твърди в статията си „Рак на бяла бреза”, че раково поражение е било излекувано с прилагане на Chaga, гъба, която расте по стеблата на бялата бреза (Betula alba L.). В допълнение, в „Shen Norg Ben Cao Jin” („Компендиум на медицинската материя” на набожния фермер) на източната династия Хан в Китай (100-200 г.) се споменават медицински гъби като Ganoderma lucidum (Рейши), Dendropolyporus umbellatus, Tremella fuciformis. Някои сортове ядливи висши базидиомицети са показали забележително забавяне растежа на различни видове тумори. Съществуват приблизително двеста сорта висши базидиомицети, които притежават това действие. Търсенето на нови анти-туморни и други медицински вещества във висшите базидиомицети и изучаването на медицинската стойност на тези ядливи гъби представлява голям интерес. Така че някои автори са комбинирали използването на гъби за хранителни (храна) и медицински цели. Гъбите обикновено са използвани като адаптогени и имуностимуланти. Първо дефиниран от Брекман (1980), адаптоген е всяко вещество, което отговаря на определени критерии за категорията на естествен растителен[4] „модификатор на биологичния отговор” (BRM) или имуностимулатор. BRM са онези агенти или подходи, които модифицират биологичния отговор на приемника чрез стимулиране на имунната система, което може да доведе до различни терапевтични ефекти. Критериите за BRM са:

• Не трябва да нанася вреда и не трябва да води до допълнителен стрес за тялото.
• Трябва да помогне на тялото да се адаптира към различни психологически стресове и такива на средата.
• Трябва да има неспецифично действие върху тялото, подкрепяйки всички основни системи, вкл. нервна, хормонална и имунна система, както и регулиращите функции.

Голям брой съединения, извлечени от гъби, както клетъчни компоненти, така и вторични метаболити, са показали въздействие върху имунната система и могат да се използват за лечение на различни болестни състояния. Тези, които засилват или подобряват съпротивата на приемника, се търсят за лечение на рак, болести на имунна недостатъчност (вкл. СПИН) или при обобщено имунно подтискане след лечение с лекарства. Ядливите висши базидиомицети са ценени заради техните хранителни стойности и приемливост, както и заради фармакологичните им свойства. Гъбите са функционална храна и източник на физиологично полезни и невредни лекарства. Доказано е, че гъбите имат значителни фармакологични ефекти или физиологични свойства, като биорегулиране (имунологично засилване), поддържане на хомеостаза, регулиране на биоритъма, лечение на различни болести и предпазване и излекуване от животозастрашаващи болести като рак, церебрален удар и болести на сърцето. Потвърдено е също, че гъбите имат ефективни вещества за намаляване на кръвния холестерол и могат да имат хиполипемични, анти-тромботични, хипотензивни и други приложения (вж. табл. 1, Приложение 1). Използвайки експериментални животни са разработени методи за ин виво тестване на физиологично активните компоненти на гъбите. Този преглед разглежда някои от най-скоро изолираните и идентифицирани вещества от гъбен произход, които са обещаващи имуномодулатори и са демонстрирали значителни анти-туморни, кардиоваскуларни, анти-вирусни, анти-бактериални, анти-паразитни, хепатозащитни и анти-диабетични свойства. Анти-туморни вещества от гъбен произход Ракът е втората най-голяма причина за смъртта на деца и възрастни, отнемайки повече от 6 милиона живота по света всяка година. Химиопредпазването (т.е. предпазване от рак чрез инжектиране на химични агенти, които намаляват риска от карциногенезис) е един от най-преките начини за намаляване заболеваемостта и смъртността. Раковите химопредпазни агенти включват нестероидни антивъзпалителни лекарства (NSAIDs) като аспирин, ибопрофен, пироксикам, сулиндак и индометацин. Чрез изследване механизма на действие на NSAIDs, циклооксигеназа (COS, PGHS или PGH, простагландин-ендопероксид синтаза, ЕС 1.14.99.1) се установи като ключов ензим, отговорен за производството на простаноид. Превръщането на арахидонова киселина в простагландин G₂ после в простагландин Н₂ се катализира чрез два ензима – СОХ-1 и СОХ-2. СОХ-1 е изоформ на СОХ, ключов ензим в биосинтеза на простагландин. Втори изоформ (СОХ-2) е въведен във възпалените клетки като моноцити и макрофаги при стимулация чрез цитокини, митогени, серум и ендотоксини. Конвенционалните NSAIDs, като сулиндак или индометацин, забавят двете форми на ензимите СОХ-1 и СОХ-2, но се търсят нови NSAIDs, които забавят избрано СОХ-2. Нови данни сочат, че СОХ-2 играе ключова роля в туморния генезис, и показват, че избрани забавители на СОХ-2 могат да бъдат нов клас терапевтични лекарства за подходящи химопредпазни агенти за много видове рак. Днес, в началото на третото хилядолетие, защитни и специфични лекарства срещу рак не са разработени с ваксини и антибиотици. Тъй като раковите клетки произлизат от нормални клетки, които избягват контрол на растежа и стават злокачествени, може да е приложимо да има нови лекарства, които не увреждат нормалните клетки на приемника, а предпазват от карциногенезис и забавят растежа само на раковите клетки. В последно време вниманието е насочено към разработването на имунна терапия, която да установи и елиминира раковите клетки, както и към вещества, като имуноусилватели, имуноинициатори и BRM, които предпазват от карциногенезис и предизвикват карцинозабавяне. В търсене на нови ракови химопредпазни агенти през последните няколко години, стотици растителни екстракти са оценени за потенциала им да забавят СОХ. Например, екстракт от Cassia quinquangulata, срещана в Перу, беше идентифициран като потенциален забавител, а на базата на фракция, получена от биоанализ, резвератрол (3,5,4’-трихидрокси-транс-стилбен) беше установен като активното вещество. Резвератрол, фитоалексин, открит в гроздето и други хранителни продукти, беше пречистен и показа раково химопредпазно действие в пробен представител на три основни етапа на карциногенезис. Резвератрол действаше като антиоксидант и антимутаген, и предизвикваше фаза ІІ ензими, метаболизиращи лекарства (анти-иницииращо действие). Той спомагаше за антивъзпалителни ефекти и забавяше функциите на СОХ и хидроксипероксид (анти-насърчаващо действие), и предизвикваше разграничаване на клетките на човешка промиелоцитна левкемия (анти-прогресивно действие). В допълнение, той забавяше развитието на пренеопластични поражения в млечните жлези на карциноген-третирана мишка в култура и забавяше туморгенезиса в модел на мишка с рак на кожата. Тези данни подсказаха, че резвератрол, обичайна съставка на човешката диета, заслужава изследване като потенциален раков химопредпазващ агент в хората. От много години е известно, че избрани гъби, произхождащи от по-високи базидиомицети, са ефективни срещу рак на стомаха, хранопровода, белите дробове и др. Компонентите, обаче, които предизвикват такова действие, все още не са напълно идентифицирани. Анти-туморното действие на висшите базидиомицети беше демонстрирано за първи път от Лукас и неговите сътрудници (1957), които използваха екстракти от плодни тела на Boletus edulis и други хомобазидиомицети в тестове срещу Сарком 180 линия в мишки. През 60-те години на ХХ век калвацинът беше най-често цитираният естествен продукт, изолиран от медицинската гъба и широко използван в много лаборатории като анти-туморен агент. Калвацин беше изолиран от гигантската прахавица (Calvatia (=Langermannia) gigantea) от Лукас и колегите му. Интересно е да се отбележи, че калвацинът се появи косвено от древното приложение и потвърждение на народната медицина. Калвацин беше тестван срещу много експериментални тумори, вкл. Сарком 180, млечен аденокарцином 755, левкемия L-1210 и HeLa клетъчна линия. През 1962г. Йохида и сътрудниците му изолират от Lampteromyces japonicus (Kawaruma) Синг, агент, активен срещу Ehrlich карцином на мишката. Грегори и сътрудници (1966) изследваха повече от 7000 култури на висши базидиомицети за анти-туморно действие срещу три разяждащи туморни системи. Петдесет култури, представящи 22 сорта, произведоха във ферментираща среда материали, показващи забавящи ефекти срещу Сарком 180, млечен аденокарцином 755 и левкемия L-1210. Ikakawa и колегите му (1968, 1969) съобщиха, че екстракти в гореща вода, получени от плодните тела на седем ядливи диворастящи висши базидиомицети (Auriculia auricular-judae, Flammulina velutipes, Lentinus edodes, Pholiota nameko, Pleurotus ostreatus, P. Spodoleucus, Tricholoma matsutake) показаха (освен A. auricular-judae) определено анти-туморно действие, опосредствано от приемника, срещу Сарком 180 в швейцарските мишки албиноси. Те също предоставиха данни относно компонент на фракция, получена във вода от L. edodes (Шиитаке гъба), която показа 94.8% ръст на туморно забавяне при доза от 200 мг/кг/ден. Интересно е да се отбележи, че компонентът, получен в алкалин, даде само 62.5% ръст на туморно забавяне при същата доза. Бял прах беше също получен чрез ацетонова утайка на фракция във вода. Туморът напълно регресира в шест от деветте мишки при същата доза. Не се забеляза загуба на тегло при третираните мишки. Използвайки стандартни методи на фракциониране и пречистване на полизахариди (вж. фиг. 1, Приложение 2), Chihara и колегите му (1969, 1970а,в) изолираха водоразтворим анти-туморен полизахарид от плодните тела на Lentinus edodes, който беше наречен „Лентинан” заради родовото име на тази гъба. Chihara определи анти-туморните свойства на L. edodes и обяви, че лентинан „почти напълно регресира туморите от плътен тип в синергична система А на приемник с тумор”. Анти-туморният ефект на лентинан беше първоначално потвърден чрез използване на Сарком 180, имплантиран в CD01/ICS мишки. Оттогава досега много изследователи са изолирали важни полизахаридни вещества. Всяко едно от тях беше b-D-глюкан, полизахарид, добиващ D-глюкоза чрез киселинна хидролиза. В допълнение към b-D-глюкан, голям брой анти-туморни компоненти с високо молекулно тегло бяха изолирани от медицински гъби, вкл. хетерогликани, хитинови вещества, пептидогликани, протеогликани, лектини, РНК компоненти, диетични фибри и/или несмилаеми полизахариди. Освен това, в резултат на наблюдения на забавяне растежа на култивирани ракови клетки като тези в карцином на цервикалния канал на маточната шийка и черния дроб, голям брой органични вещества с ниско молекулно тегло като терпеноиди, стероиди, нови гама-пирони и нови феноли, бяха изолирани от гъби и идентифицирани. Полизахариди, демонстриращи забележително анти-туморно действие ин виво, бяха изолирани от различни сортове гъби, принадлежащи към Auriculariales, Tremellales, Polyporales, Gasteromycetideae и Agaricomycetideae (вж. табл. 2, Приложение 1), чрез наблюдения срещу Сарком 180 в мишки, и интраперитонеален (i.p.) или орален (p.o.) метод на администриране. Тези анти-туморни вещества се смятат за BRM, които предават свойствата си чрез активиране на имунологичната функция на приемника. Принципният компонент на тези вещества е (1-3)-β-D-глукани. Тези компоненти се характеризират с антигенност и липса на странични ефекти. В Япония, Русия, Китай и САЩ няколко полизахаридни карциностатични агенти са развити и комерсиализирани, използвайки биомаса от потопена мицелна култура на Trametes versicolor, плодни тела на Lentinus edodes, Inonotus obliquus, Agaricus blazei, течен култивиран продукт от Schizophyllum commune. β-D-глюкани Анти-туморните полизахариди[5], изолирани от гъби (плодно тяло, биомаса от потопена мицелна култура и течна култура), са показани на табл. 2, Приложение 1. В резултат на изследването беше изяснено, че активните β-D-глюкани показват тройно-нишковидна дясно-извита спирална структура. β-D-глюкани от гъби не винаги показват анти-туморно действие. Различията в действието могат да са свързани с разтворимостта във вода, размера на молекулите, степента на разклоняване, и форма, (1-6)-свързваща система в β-(1-3) основна верига. Трябва да се отбележи, че оптималната доза (i.p. или p.o.) все още не е определена. Сравнително голям брой β-глюкани се получават с разредени алкали, които са неразтворими във вода. Направени са няколко опита да се засили действието чрез химична модификация. β-глюкани, получени от Auricularia auricular-judae и Dendropolyporus umbellatus, са направени по-водоразтворими чрез няколко модификации:

• Карбоксиметилация
• Хидроксиетилация
• Полиалкохоли, формирани чрез намаляване на BH₄ след оксидация на IO₄
• β-(1-6) елиминиране на разклоняване чрез лека Смит деградация
• глюкопираносил остатък в основната верига на β-(1-3)-D-глюкан е частично превърнат в 3.6-анхидроглюкопираносил остатък, манопираносил остатък, и манносамино пираносил остатък.

β-D-глюканът от гъбата Lentinus edodes, лентинан, е изследван по-обширно от другите подобни вещества. Лентинанът показва забележително анти-туморно действие не само срещу алогенни тумори като Сарком 180, а и срещу различни синергични и автохтонни тумори, и предотвратява химични и вирусни онкогенезиси. Молекулната формула на лентинана е (С₆Н₁₀О₅)n, средното молекулно тегло е около един милион – 5 х 10⁵ Da, [a]_D + 20° – 22° (NaOH). Той е β-D-глюкан, което се показва чрез електрофореза и ултрацентрофуга, както и чрез други химични техники и инструментален анализ. Лентинанът не е токсичен за туморните клетки, но забавя растежа на тумора чрез стимулиране на имунната система. Това става като β-D-глюканът се свързва с лимфоцитните повърхности или серум специфични протеини, които активират макрофаги, Т-хелпери, NK и др. влияещи клетки. Всички те засилват производството на антитела, както и интерлевкини (IL-1, IL-2) и интерферон (IFN-g), които се отделят при активиране на влияещите клетки. Така карциностатичният ефект на лентинана произлиза от активирането на имунната система на приемника. При тестване на карциностатичното действие с животни се използва i.p., но понякога p.o. е ефективен. В сравнение с други ракови химиотерапевтични агенти, рядко се наблюдават токсичност и вредни реакции на лентинан. С чист β-D-глюкан няма антиген-антитяло реакция, нито други нарушения като алергия, шок, и т.н. Туморното действие на лентинана беше значително по-силно от това на полизахариди от много други фунги (вкл. лишеи) или от по-висши растения. Той изглежда е активен при определени животни за някои, но не всички видове тумори. Данни за анти-туморното действие, предотвратяване на метастази и подтискане на химичен и вирусен онкогенезис чрез лентинан са показани в табл. 3, Приложение 1. Хетерополизахариди и гликопротеини В допълнение към водоразтворимите β-D-глюкани, гъбите съдържат също β-D-глюкани с хетерозахаридни вериги на ксилоза, маноза, галактоза и уронова киселина, извлечени от соли и киселини, и β-D-глюкан-протеинови комплекси, присъстващи при 10 до 50% в сухо вещество. Някои от тях показаха забележителни карциностатични ефекти не само чрез интраперитонеална инжекция, а също чрез орална доза (вж. табл. 2, Приложение 1). В допълнение към β-D-глюкани, глюкуроноглюкан, ксилоглюкан, унанноглюкан, ксиломанноглюкан и други активни хетероглюкани и техните протеинни комплекси бяха извлечени от Ganoderma lucidum за медицинска употреба и пречистени чрез соли, киселини и DMSO. От екстракт на мицелна култура на Lentinus edodes беше изолиран a-маннен пептид (KS-2). Полизахарид KS-2 (MW 6-9.5 x 10⁴ [a]_D = 62°C = 0.5 вода) беше получен чрез екстракция на мицелна култура на L. edodes (щам KSLE 007) с топла вода, следвана от утаяване с етанол. Продуктът е a-маннен пептид, съдържащ аминокиселините серин, треонин, аланин и пролин (както и остатъчни количества от други аминокиселини). Оказа се, че KS-2 има ефект върху Сарком 180 и Ehrlich карцином, или i.p. или p.o., и действа чрез интерферон-индуцирана активност. Острият LD₅₀ на KS-2 е изключително висок в мишки, повече от 12500 мг/кг, когато се администрира орално. Механизмът на действие на KS-2 не е ясен, въпреки че резултатите не показаха пряк цитолизен ефект на KS-2 срещу туморни клетки ин витро. Неговото анти-туморно действие е по-високо при по-ниския ваксинен размер на туморните клетки, независимо от пътищата на администриране на KS-2 (60% ръст на оцеляване при 5 х 10³ туморни клетки/мишка, 10% оцеляване при 1 х 10⁶ туморни клетки/мишка). Резултатите показаха също, че анти-туморното действие на KS-2 в мишки беше винаги съпроводено с предизвикване на интерферон в серумите. Освен това, предварителни резултати показаха, че макрофагите, получени от мишки, третирани с KS-2, показаха действие, убиващо туморите. Schultz и др. (1977) установиха, че макрофагите убиват тумори, когато са инкубирани ин витро с интерферон. Имайки предвид тези изводи, анти-туморното действие на KS-2 може да се обясни с активиране на макрофаги с или без предизвикване на интерферон чрез KS-2. LEM и LAP екстракти от мицелна и културна среда на гъба L. edodes са гликопротеини, съдържащи глюкоза, галактоза, ксилоза, арабиноза, манноза и фруктоза. LEM съдържа също различни производни на нуклеинова киселина, витамин B компоненти, особено B₁ (тиамин), B₂ (рибофлавин) и ергостерол. LEM беше приготвен от екстракт от прахов мицел на L. edodes. След инкубация на мицела в плътна среда при 20 до 22°С за 80 до 120 дни и преди даване на плод, средата беше направена на прах и по-нататък инкубирана в присъствието на ензими, естествено присъстващи в мицела, за 50 до 60 часа при 40 до 50°С (частично хидролизирана в процеса). Когато реакцията завърши, остатъкът беше извлечен с вода (60°С), а филтратът беше замразено изсушен. Полученият светлокафяв прах беше LEM. Добивът на LEM е около 6 до 7 г/кг среда. Утайката, получена от воден разтвор на LEM чрез добавяне на 4 обема етанол, беше наречена LAP, а добивът на LAP е = 0.3 г/г от LEM. LEM и LAP демонстрираха силно анти-туморно действие, както орално, така и чрез инжектиране при животни и хора. И двата показаха активиране на имунната система на приемника. През 1990 г. от фракционация на LEM беше получено имуноактивно вещество, ЕР3. ЕР3 е лигнинен комплекс, съставен от приблизително 80% лигнин, 10% въглехидрати и 10% протеин. След премахването на въглехидратите и протеина, биологичното действие не се промени, но когато се премахна лигнина, действието намаля. Следователно активното вещество е водоразтворим лигнин, съдържащ много карбоксилни групи. От мицелна култура на Agaricus blazei беше изолиран глюкоманнан-протеин комплекс (АТОМ), а от култивиран филтрат – маннан-протеин комплекс (AB-FP). Както АТОМ, така и AB-FP показаха определено анти-туморно действие. От плодните тела на A. blazei беше изолиран водоразтворим β-(1-6)-D-глюкан протеин комплекс (полизахариди: протеин = 50:43 w/w), в допълнение към водоразтворим β-(1-3)-глюкан. За първи път определеното анти-раково действие беше забелязано на β-(1-6)-D-глюкан. От плодното тяло на Flammulina velutipes беше изолиран β-глюкан-протеин (ЕА₆). ЕА₆ съдържа С 41.39%, Н 6.92%, N 3.82%, захарид 70%, протеин 30%, [a]_D-14.2° (с = 0.5, Н₂О), и се състои от глюкоза, галактоза, манноза, ксилоза, арабиноза и 16 аминокиселини. ЕА₆ показа силно анти-туморно действие срещу Сарком 180, Lewis рак на белите дробове и В-16 меланом. В допълнение към изследванията на плодното тяло на F. velutipes, нов анти-туморен гликопротеин беше открит в култивирания мицел. Този гликопротеин беше наречен „Профламин”. Профламин е водоразтворим гликопротеин с молекулно тегло 13,000±4,000 [a]_D-52-57° (с = 0.1, 0.1 N NaOH), съдържа 90% протеин и 10% захарид. Профламин беше изолиран по метода, показан на фиг. 2, Приложение 2. Профламин е ефективен срещу алогенни и синергенни тумори чрез орално администриране. Така той е ефективен срещу Сарком 180, В-16 меланом, аденокарцином 755, и Гарднър лимфом. Той е също полезен в комбинирана терапия с други анти-туморни агенти. Профламин засилва формирането на антитела и активира лимфоцитния бластогенезис. Бяха изследвани анти-туморните действия на Dictyophora indusiata (T-2-HN, T-4-N и T-5-N) срещу плътен тумор Сарком 180. Силата на анти-туморните действия на разклонените (1-3)-β-D-глюкани (T-4-N и T-5-N), и двата извлечени с киселинни разтвори и разтворими във вода, беше по-слаба от тази на водно-извлечени (1-3)- β-D-глюкани, изолирани от други гъби (Lentinus edodes, Ganoderma lucidum, Hericium erinaceus). По-специално, T-4-N има много по-високо молекулно тегло (MW:5.5 x 10⁵ в 0.25 M NaOH), което показва, че анти-туморното действие на разклонените (1-3)- β-D-глюкани зависи от молекулните им тегла. От друга страна, частично О-ацетилирани (1-3)-β-D-глюкани (T-2-HN) показват значително анти-туморно действие при доза само 25 мг/кг/ден х 10, въпреки че не се наблюдава пълна регресия на тумора в мишките. Диетични фибри Материалите с високо молекулно тегло, изхвърляни без храносмилане и усвояване от човешкия организъм, се наричат диетични фибри. Гъбите съдържат диетични фибри, принадлежащи към β-глюкани, хитин и хетерополизахариди (пектинни вещества, хемицелулози, полиурониди и др.) – до 10-50% в сухо вещество. Повечето от активните полизахариди, водоразтворими или водонеразтворими, изолирани от гъби, могат да бъдат класифицирани като диетични фибри (т.е. β-глюкани, ксилоглюкан, хетероглюкан, хитинно вещество и техни протеинни комплекси). Тъй като β-глюкани и хитиновите вещества с карциностатично действие се съдържат предимно в диетичните фибри на гъби и чрез физико-химични взаимодействия те абсорбират вредни материали, като карциногенни вещества, и така предотвратяват усвояването им в червата и ускоряват тяхното изхвърляне (разслабително действие). По този начин те могат ефективно да предотвратят рак на дебелото черво и ректума. Лектини Терминът „лектин” се определя като въглехидрат-протеин от неимунен произход, който аглутинира клетки или утаява полизахариди или гликосъединения. Наскоро няколко лектина бяха изолирани и пречистени от гъби висши базидиомицети. Лектините са протеини или гликопротеини със силно специфични въглехидратни функционални групи. Те определят жизненоважни клетки като еритроцити и свързани полизахариди, комплексни въглехидрати и протеини. Фунгалните лектини се използват за изучаване на полизахариди и гликопротеини, както и ензимни модификации и клетъчни мембрани. Поради характерните им редици, тези материали могат да се използват за афинитетна хроматография, за диагноза на ракови клетки или като специфични свързващи функционални групи за целева ракова терапия. Например, N-ацетилгалактозамин специфичен лектин беше изолиран от плодното тяло на Grifola frondosa GFL. Изолираният лектин аглутинираше всички видове еритроцити еднакво. Молекулното тегло, изчислено чрез гелова филтрация в различни буфери и матрици, варира от 30 до 52 kDa. GFL е цитотоксичен срещу HeLa клетки. Резултатите, получени от Kawagishi (1995), показаха, че цитотоксичността на лектина от същите Polyporales гъби срещу HeLa клетки е резултат от свързването на лектина с въглехидратните области на клетките, и е независима от струпване на клетки чрез лектина. Терпеноиди Някои терпеноиди и техните производни, изолирани от гъби Polyporales и Ganodermatales, са токсични. Тези съединения са кандидати за анти-туморни агенти. Наистина, около 100 различни тритерпеноиди могат да се намерят в плодните тела и мицели на Ganoderma lucidum и G. applanatum. Те включват високо оксидирани тритерпеноиди от ланостанин тип, като ганодерни киселини A, B, C₁, C₂, D₁, D₂, E₁, E₂, F, G, H, I, J, K₁, K₂, L Ma, Mb, Mc, Md, Me, Mf, Mg, Mi, Mj, Mk, Mn, N, O, P, Q, S, T, U, V, W, X, Y и Z, 7-0-метил ганодерна киселина О, тридеацетил ганодерна киселина Т, ганодерни киселини A, B, C, D, E, F, G, H, I, ганодерни киселини A, B, C, D и E, lucidenic киселини A, B, C, D₁, D₂, E₁, E₂, F, G, H, I, J, K, L, M, ганодериол тип 1 (A, B, F) и тип 2 (C, D, E, F, G, H и I), ганодерал А и В, епоксиганодериол А, В, С, лусидон А, В, С, фураганодерна киселина и други терпеноидни компоненти (цялата литература е цитирана в Wasser and Weis, 1997a, 1999). Структурите на терпеноидите от сортовете Ganoderma имат ланостанен скелет и са класифицирани в няколко групи въз основа на въглеродни номера и състояние на оксидация. Някои тритерпеноиди (например ганодерни киселини R, T, U-Z), изолирани от биомаса от потопена мицелна култура, забавят растежа на хепатомни клетки ин витро. Omphalotus olearius и Lampteromyces japonicas произвеждат цитотоксичен трицикличен sesquiterpene, illudin S = lamterol, който показва анти-ракови свойства и забавя растежа на раковата клетка чрез уникален механизъм. Смята се, че illudin S претърпява активиране чрез глутатион. След това активираната форма може да направи ковалентна химична връзка с ДНК. Това спира копирането на ДНК и води до смърт на клетката. Самият illudin S е твърде токсичен за използване като клинично лекарство. Полусинтетичен аналог на illudin, 6-хидроксиметилацилфулвен (HMAF), демонстрира по-добър терапевтичен профил и по-ниска токсичност. Съединението е получено от illudin S чрез ферментация със средствата на модифицирана Prins реакция. HMAF показва отличен профил на забавяне на анти-туморния растеж, оценявайки ин витро и ин виво ксенографски модели. Той е особено обещаващ при предизвикване на туморна регресия в упорити туморни клетъчни линии, като рак на белите дробове MV-522 и рак на дебелото черво HT-29. HMAF забавя също растежа на ракови клетъчни линии, устойчиви на много лекарства. Поради своя изключителен терапевтичен профил, HMAF в момента преминава фаза І на човешки клинични тестове и обещава да се превърне в ценно ново анти-раково лекарство. По време на изследвания на токсични елементи, екстрактът от L. japonicas показа анти-туморно действие в туморни модели с гризачи. Illudin S е активният елемент. Наскоро анти-раковото действие на illudin S и М беше отново оценено, използвайки човешки туморни клетъчни линии, и стана ясно, че те показват избрана токсичност към определени туморни клетки и са ефективни срещу онези, устойчиви на традиционните химиотерапевтични агенти; в последствие се стигна до извода, че могат да имат потенциална терапевтична употреба. McMorris и колегите му (1992) откриха, че illudins се държат като двуфункционални алкилиращи агенти, а аналог, dehydroilludin M, показа подобрен терапевтичен индекс. Повторното изследване на екстракт от култура от Omphalotus olearius доведе до изолиране на няколко конгенери, като illudin А и В. Leaianafulvene, изолиран наскоро от Mycena leaiana, също принадлежи към циклохумуланоидите. Вероятно е получен от илуданен скелет чрез 1,2-миграция на предишен метил от гемдиметил група. Leaianafulvene е пигмент на гъбата M. leaiana и е цитотоксичен. Цитотоксичните действия на leaianafulvene са достатъчно обяснени. 50% лизис на клетки на Ehrlich аскетичен тумор (ЕСА) бяха наблюдавани при 2.5 (mg ml^-1. В ЕСА клетки смесването на ¹⁴С-тимидин и ¹⁴С-уридин в трихролацетичен и осезаем материал (ДНК, РНК) беше забавено 50% при 10 (mg ml^-1, докато смесването на ¹⁴С-левцин в протеин не се повлия. В опита за мутагенно действие (спот тест без чернодробни микрозоми на плъх) leaianafulvene значително увеличи броя на ревертанти от Salmonella typhimurium TA 100, показвайки мутагенно действие за това съединение. Имуномодулиращи ефекти Полизахаридите от гъби не атакуват директно раковите клетки, а предизвикват техни анти-туморни ефекти чрез активиране на различни имунни отговори в приемника. Имуномодулаторите действат предимно чрез засилване действието на макрофагите. Макрофагите са бели кръвни клетки, които „изяждат” и разрушават патогени, като бактерии, дрождни клетки, вирус-инфектирани клетки, и др. Те присъстват в голям брой в лигавиците на тялото – особено в храносмилателния, пикочен и дихателен тракт. Те играят също роля в ретикулоендотелиалната система, която е система на имунни клетки в далака, черния дроб и лимфоидните тъкани, които поглъщат складирана вода и токсични химикали. Макрофаги и други фагоцити могат да се разглеждат като защитния щит на тялото. Стимулирането на този аспект на имунната система помага в защитата срещу настинка, грип, възпаления от всякакъв вид. Днес е известно, че много гъбни полизахариди от Tremella fuciformis, Schizophyllum commune, Dendropolyporus umbellatus, Grifola frondosa, Hericium erinaceus, Inonotus obliquus, Ganoderma lucidum, G. Applanatum, Lentinus edodes и Flaminulina velutipes и др. (вж. табл. 1 и 2, Приложение 1) показаха способност да стимулират действието на макрофагите и засилват имунната система. От всички изследвани гъбни имуномодулатори най-ефективен е лентинан, от Lentinus edodes. Лентинанът действа като усилвател на защитата на приемника (HDP), който е способен да възстанови или засили отзивчивостта на клетките на приемника към лимфоцитокини (интерлевкини), хормони и др. биологично активни вещества чрез стимулиране на съзряване, диференциация или пролиферация на клетки, включени в защитните механизми на приемника. HDP са функционално различни от модификаторите на биологичен отговор. Така например лентинанът е способен да увеличи съпротивата на приемника срещу различни видове рак и вирусни заболявания, вкл. СПИН. Първоначалните взаимодействия на лентинана в човешкото тяло или животни не са известни до момента. Все пак, съществува временно но видимо увеличаване на няколко серумни протеинни компоненти в a- и b-глобулин регион, например допълнителен С3, хемопексин и церулоплазмин. Лентинанът стимулира различни видове естествени клетки убийци (NK-клетки), Т-клетки, В-клетки и отговори на имунната система, зависещи от макрофаги. Анти-туморният ефект на лентинан е премахнат чрез неонатална тимектомия и намален чрез администриране на анти-лимфоцитен серум, поддържайки концепцията, че лентинан изисква имунокомпетентни Т-клетки отделения. Ефектът на лентинана беше забавен и чрез анти-макрофагни агенти, като карагинан. За разлика от други добре известни имуностимуланти, лентинанът е в единствен по рода си клас от асистенти, ориентирани към DT-клетки, в които макрофагите играят роля. Например, лентинанът може да активира NK-клетки ин витро в същите концентрации, които са постигнати в кръвната плазма на пациенти, третирани клинично с лентинан. Действието на NK-клетки участва в туморното потискане, и докато тези клетки не стимулират действието на Т-клетки убийци, или правят това само при определени условия, не са силни Т-клетки хелпери стимуланти ин витро и ин виво. Използвайки кръвта на здрави донори и пациенти с рак, някои автори показаха, че лентинанът може да стимулира периферните кръвни лимфоцити ин витро за увеличаване действието на интерлевкин 2-пренесени LAK-клетки (лимфокин-активирана клетка убиец) и NK-клетки до нива, достижими ин виво чрез администриране на клинични дози лентинан. Лентинанът забавя действието на Т-клетки ин виво и увеличава съотношението на активирани Т-клетки и цитотоксични Т-клетки в далака, когато се администрира при пациенти с рак на стомаха, провеждайки химиотерапия. Бяха отбелязани много интересни биологични действия на лентинана, вкл. (а) засилване активирането на неспецифични възпалителни отговори като производство на АРР (остра фаза протеин); (б) васкуларна дилатация и кървене ин виво; (в) активиране и генериране на помощни и цитотоксични Т-клетки; (г) засилване на имунните посредници като интерлевкини 1 и 3, фактор(и), стимулиращи колония, и фактор, забавящ миграцията; и (д) увеличаване капацитета на PBM (периферни кръвни мононуклидни) клетки на пациенти с рак на стомаха, и произвеждане IL-1a, IL-2b, и фактор на туморна некроза (TNFa). Таблица 4, Приложение 1 показва различните биологични действия на лентинана като HDP. В ин виво изследвания на плъхове с перитонит, комбинирано лентинан-гентамицин лечение доведе до значително по-добро ниво на оцеляване, отколкото в контролната група. Лентинанът активира перитонеални макрофаги, отделително действие на активен кислород и произведени цитокини, които увеличават способността на PMN (полиморфонуклидни левкоцити) да произвеждат активен кислород, който има бактеро-убиващ ефект. Лентинанът също увеличава токсичността на перитонеалните макрофаги срещу метастазни туморни клетки в мишки, но не е ефективен срещу високо-метастазен вид тумор. Някои пациенти, третирани с лентинан за карциномен плеврит или карциномен перитонит, се подобриха с изчезването на злокачествеността. Лентинанът може да активира нормалните и алтернативни пътища на допълнителната система и може да раздели С3 на С3а и С3в, засилвайки активацията на макрофаги. Лентинан засилва и предизвиква много биологични реакции, вкл. много важното явление на инфилтриране на еозинофили, неутрофили и гранулоцити около целеви тъкани. Фигура 3, Приложение 2 показва ранни отговори, предизвикани от лентинан, и възможни пътища за възпалителни реакции (вж. табл. 4, Приложение 1). Имуноактивиращата способност на лентинана може да се свърже с модулиране му на хормонални фактори, които играят роля в туморния растеж. Aoki (1984а) показа, че анти-туморното действие на лентинана силно намалява чрез администриране на тироксин или хидрокортизон. Лентинанът може също да възстанови туморно-специфична хиперчувствителна реакция от забавен тип, ориентирана към антиген (DTHR). Лентинанът не е официално включен сред неспецифичните имуностимуланти (RES стимуланти), но той увеличава производството на антиген-специфични цитотоксични Т-лимфоцити, макрофаги и други неспецифични имунни отговори. Възможните регулиращи действия на лентинана върху имунната система са резюмирани от Chihara (1981) на фиг. 4, Приложение 2. Кардиоваскуларни и хиперхолестеролемни ефекти Огромна причина за смърт в западните държави е болест на коронарната артерия. Основен рисков фактор е хиперхолестеролемията, която води до втвърдяване на артериите. При хората 50% или повече от общия холестерол се получава от de novo синтез. Изследвания на клинична намеса демонстрираха терапевтичното значение на коригиране на хиперхолестеролемията. Първата стъпка за намаляване на холестерола е специална диета с ниско съдържание на мазнини и наситени мастни киселини и богата на несмилаеми фибри. Лечение с лекарства е следващата стъпка. Най-добрият известен фармакологичен агент, одобрен през 1987 г., е ловастатин (мевинолин) и неговите аналози. Това вещество с ниско молекулно тегло е конкурентен инхибитор на HMG CoA редуктаза, ключовият ензим в метаболизма на холестерол, който катализира редукцията на HMG CoA до мевалонова. Най-добрите организми за потенциални производители на ловастатин от ядливи гъби висши базидиомицети са сортове от рода Pleurotus. Присъствието на инхибитора беше определено в четири сорта: P. ostreatus, P. cornucopiae, P. eryngii и P. sapidus. По-високото съдържание на ловастатин беше открито в плодните тела на P. ostreatus. Появата на инхибитора по време на развитието на плодните тела беше проследено и ловастатин беше открит във вегетативния мицел, в примордии и в различни части на плодните тела с различни размери; в стеблото беше открит по-малко ловастатин, отколкото в гуглата (вж. фиг. 5, Приложение 2) или в естествени етапи в люспите и базидиоспорите. Оказа се, че ловастатинът в началото на растежа на гъбата е за съжаление разпределен в малки плодни тела, и няма съществени разлики между гуглата и стеблото. По време на растежа на плодното тяло повечето ловастатин се премества първо в гуглата, а после в люспите. Зрелите плодни тела имат диаметър приблизително 15 см и отделят голям брой базидиоспори. Те съдържат по-малко ловастатин в люспите, в сравнение с по-малките, 10 см в диаметър, по-малко зрели плодни тела. Тези данни бяха в основата на заключението, че част от ловастатина в напълно зряла гъба вероятно се премества в базидиоспорите, а в по-незрелите гъби това преместване е все още непълно. Серия от експерименти, проведени от Bonek и колеги (1991а, в, 1993), показаха, че добавяне на 2 до 4% P. ostreatus към хиперлипидемичната диета ефективно предпазва от акумулиране на С и triaclyglycerol в серумите и черния дроб на животни с екзогенни, ендогенни или генетично причинени хиперлипемии. VLDL холестерол има доминираща роля в редукцията на серум С до 80%, от цялата гъба или нейната вода, и 30% етанолови екстракти. Авторите отдадоха този ефект на комплекса от фибри и пулпа на стридната гъба, който ограничава резорбцията на С и гастрочревния тракт, както и на неопределено вещество, което също влияе върху метаболизма извън фазата на резорбция. Ryong и колеги (1989) тестваха алкохолни и водни екстракти на 20 различни ядливи гъби в тъканна първична култура от клетки, изолирани от атеросклерозно действие. Четири гъби, вкл. P. cornucopiae, показаха ефекти ин витро. Потреблението на тези гъби намали също атерогенните ефекти с 20 до 40% в серумите, събрани от пациенти с коронарна сърдечна болест. В тези експерименти ефектът от диетичните фибри беше изключен, а ефективността беше отдадена на неизвестен активен компонент. Авторите предположиха, че това неизвестно вещество е ловастатин, който може да се открие във високи количества в плодните тела на различни култури сортове Pleurotus. Следователно, зрелите плодни тела на P. ostreatus могат да се препоръчат за потребление като естествен агент, понижаващ холестерола. Ловастатинът се появява рано в жизнения цикъл на гъбата в мицелите, от които се формират примордиите. Известно е, че Lentinus edodes е способна да понижи BSC чрез фактор, известен като еритаденин (наричан също „Лентинацин” или „Лентизин”). Еритаденинът беше изолиран от 80% етанолов екстракт от плодните тела на гъба Шиитаке чрез абсорбиране на Amberlite IR-120 (H*) колона, следвана от елуция с 4% NH₄OH. Кристалният продукт имаше следните свойства: mp 261°C, C₉H₁₁O₄N₅, MW 253, l 261.5 nm (e = 14,508), Na salt mp 266°-268°C (декомпозиция), [a]_D + 45.5° (C=1, H₂O). Хидролиза в 6N HCI при 110°C за 72 часа доведе до глицин и нова аминокиселина. Очевидно еритаденинът намалява серумния холестерол в мишките. Неговото действие не е забавяне на холестеролния биосинтез, а по-скоро засилване на изхвърлянето на погълнатия холестерол и неговата метаболично разграждане. Очевидно еритаденинът намалява BSC в мишки не чрез забавянето на холестеролния биосинтез, а чрез засилване на изхвърлянето на погълнатия холестерол и неговото метаболично разграждане. Еритаденинът намалява кръвните нива на холестерол и липиди при животни. Добавен към диетата на плъхови, еритаденинът (0.005%) причинява 25% намаление на общия холестерол само след една седмица. Действието на това вещество за понижаване на холестерола се проявява повече при плъхове, хранени с диета с много мазнини, отколкото при тези с диета с ниско съдържание на мазнини. Въпреки че хранителните изследвания при хора показаха подобен ефект, необходими са по-нататъшни системни изследвания. S. Suzuki и Ohshima (1974, 1976) показаха, че диетичната гъба Шиитаке намалява нивата на BSC. Различни изследвания потвърдиха, че гъбата шиитаке може да понижи както кръвното налягане, така и свободния холестерол в плазмата, както и да ускори акумулирането на липиди в черния дроб, чрез премахването им от циркулацията. Съединения на нуклеинова киселина в екстракт от L. edodes показаха силен забавящ ефект на аглутинация на тромбоцити (анти-тромбоцитно действие). Екстракт от L. edodes с анти-тромбоцитно действие беше изследван чрез високопроизводителна течна хроматография (HPLC). Бяха идентифицирани ATP, ADP, UDPG, 5’-GMP, 5’-UMP, 5’-CMP, 5’-AMP, уридин, еритаденин и деоксилентинацин. 5’-AMP, 5’-GMP, еритаденин и деоксилентинацин показаха по-голямо анти-тромбоцитно действие. Auricularia auricular-judae показа следните ефекти и действия в изследвания на мишки и плъхове: антикоагулация, понижени нива на общ холестерол, триглицериди и липиди; и антиагрегатно действие на кръвните тромбоцити, което може да я направи полезна за коронарна сърдечна болест. Тази гъба традиционно се използва като имунен тоник. Екстракти от полизахариди и спори от Tremella fuciformis демонстрираха анти-липидно действие. T. fuciformis понижи LDL-холестерола при плъхове, хранени със сместа, която съдържаше също масло, захар и яйчни жълтъци, с 30% над контролите. Полизахаридите от T. fuciformis удължиха формирането на тромб, намалиха размера на тромба, намалиха последователността на кръвните тромбоцити, кръвния визкозитет и повлияха положително на други параметри на кръвната коагулация на оцеляване на мишките. Изследвания с животни на Armillariella mellea демонстрираха, че тя намалява сърдечния ритъм, намалява периферното и коронарно васкуларно съпротивление и увеличава церебралния кръвен поток. AMG-1-a съединение, изолирано от тази гъба, показва церебрален защитен ефект, и засилва коронарната кислородна ефикасност без да променя кръвното налягане. Grifola frondosa понижава кръвното налягане в плъховете без да променя HDL нивата в плазмата. Adachi и колегите му (1988) откриха ефект на понижаване на кръвното налягане с прах от G. frondosa, даван на плъхове с високо кръвно налягане в нормалната храна. Ефектът беше бързо атакуващ, краткотраен и зависещ от дозата. Воден екстракт на G. frondosa също понижи нивата на серумен холестерол в плъховете. Гликопротеин, получен от биомаса от потопена култура мицелна на сортове Trametes показа действие (при животни и ин витро тестове) срещу експериментално високо кръвно налягане и тромбоцит. Протеинът забави агрегацията на кръвните тромбоцити и е анти-хиперлипемен и анти-аритмиен. Trametes versicolor понижава серумния холестерол при животни. PKS (b-глукан-протеин) от T. versicolor се използва в клинични изследвания. Tsukagoshi и колеги (1984) обявиха, че PKS предизвиква значително понижаване на LDL холестерола при пациенти с хиперлипидемия (етап ІІа). Кардиоактивните протеини от Volvariella volvacea понижават кръвното налягане. Анти-вирусни, анти-бактериални и анти-паразитни ефекти Различни вещества във висшите базидиомицети са ефективни срещу различни видове вирусни, бактериални[6] и паразитни инфекции, вкл. СПИН. Важна област на изследвания на различни вещества в гъбите висшите базидиомицети се занимава с тяхната способност да мобилизират хуморалния имунитет на тялото да се пребори с бактериални, вирусни или паразитни (вкл. микрофунги) инфекции, устойчиви на антибиотици. Много пациенти с рак и СПИН умират от опортюнистични инфекции поради нефункциониране на имунната система. Спектърът от микози и мицели при СПИН са показани в табл. 5, Приложение 1. Много е важно пациентите със СПИН да се предпазят от тези опортюнистични инфекции. Според Tochikura и колеги (1987а,в), лентинанът от Lentinus edodes, използван в комбинация с азидотимидин (AZT), подтиска повърхностното изразяване на човешкия вирус на имунната недостатъчност (HIV) върху Т-клетки повече, отколкото само AZT. Лентинан и сулфатен лентинан показаха силно анти-HIV действие, водещо до забавяне на вирусното репликиране и клетъчното сливане. СПИН терапията трябва да включва стратегия за засилване на имунната система. Сред различните терапевтични подходи, използвани при HIV пациенти, трябва да се набляга на предпазване от развитие на СПИН симптоми в носителите. Това може да се реализира чрез използване на HDP като лентинан или негови подобни вещества. Например, LEM също се използва при лечение на СПИН. Той забавя HIV инфекции на култивирани човешки Т-клетки и засилва ефектите на AZT срещу вирусната репликация ин витро. Механизмът на неговото действие все още не е известен със сигурност, но екстрактът активира макрофагите и стимулира производството на интерлевкин 1. Водоразтворими лигнани от ЕР3 и EPS4 от гъбен мицел на L. edodes показаха анти-вирусни и имуномодулиращи ефекти. Водоразтворим екстракт от мицел, известен като JLS и JLS-18, има способността да блокира отделянето на herpes simplex вирус тип 1 при животни. JLS-18, съставен от 65 до 75% лигнин, 15 до 30% полизахариди и 10 до 20% протеин, забавя херпесния вирус както ин витро, така и ин виво. В допълнение, лентинанът показва (а) анти-вирусно действие при мишки срещу VSV (vesicular stomatitis virus), енцефалитен вирус, Abelson вирус и аденовирус тип 12; (б) стимулирана неспецифична съпротива срещу дихателни вирусни инфекции при мишки; (в) осигурена пълна защита срещу LD75 предизвикателна доза на злокачествена инфлуенца при мишки A/SW15; (г) засилена бронхоалвеолна макрофагна дейност; (д) увеличена съпротива към паразити Schistosoma japonicum и Sch. mansoni; (е) показано действие срещу бацили Mycobacterium tuberculosis, устойчиви на анти-туберкулозни лекарства, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Candida Albicans и Saccharomyces cerevisiae; и (ж) увеличена съпротива на приемника към инфекции с потенциално смъртоносната Listeria monocytogenes. Анти-бактериалните полиацетиленови съединения, центинамецин А и В, също са открити в гъбата Шиитаке. Таблица 6, Приложение 1 показва анти-възпалителното действие на лентинан и неговите производни. Еритаденин, съединение, което влияе върху холестеролния метаболизъм, също има анти-вирусни свойства. Трябва да се отбележи, че протеинната фракция на плодни тела на гъбата Шиитаке, наречена FBP (протеин от плодно тяло), предпазва от заразяване на растения с tobacco mosaic virus (TMV). Захващането на вируса към клетките на растенията е забавено с FBP. Armillariella mellea показва антибиотично действие (ин витро) срещу патогенната бактерия Staphylococcus aureus, Bacillus cereus и B. subtilis. Армиларната киселина, наскоро изолирана от A. mellea, забавя Gram-позитивните бактерии и дрожди. Ин витро изследвания с мицелен екстракт на A. mellea също показаха значително анти-бактериално действие срещу Gram-позитивните бактерии. Полизахаридът шизофилан от Schizophyllum commune демонстрира защитни ефекти срещу инфекции Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae при мишки. Алкохолен екстракт на Dendropolyporus umbellatus демонстрира антибиотични действия ин витро срещу Staphylococcus aureus и Escherichia coli. Сортове от рода Trametes съдържат кориолин, антибиотик, който забавя Gram-позитивните бактерии и Trichomonas vaginalis. Sesquiterpenes velleral и isovelleral, изолирани от Lactarius vellereus, имат силно анти-бактериално (срещу Escherichia coli) и анти-фунги (Candida utilis) действие. Сортовете Ganoderma (G. lucidum, G. applanatum, G. oregonense) показаха висока степен на действие срещу видове Staphyllococcus, Streptococcus и Bacillus pneumoniae, може би поради увеличеното действие на имунната система и нейния анти-вирусен ефект, предизвикан чрез производството на интерферон. Agaricus campestis произвежда кампестрин, който е ефективен срещу Gram-позитивни и Gram-негативни бактерии. A. Bisporus и A. arvensis са устойчиви на Gram-позитивни и Gram-негативни бактерии. A. xanthoderma съдържа антибиотик псалиотин (4-хидроксибензенедиазонин), който беше отделен от течност на културата. Той е инхибитор срещу Gram-позитивни бактерии. Хепатозащитни ефекти През последните 15 до 20 години медицинските гъби бяха обект на различни лабораторни изследвания с животни, както и клинични изследвания при хора. Те се смятат полезни за голям брой разстройства на черния дроб, вкл. хепатит. Хепатит В, например, се разпространява най-вече чрез кръвен контакт, секс и раждане. Според Световната здравна организация (СЗО) днес 350 милиона души по света се заразяват с този вирус. Повечето нямат симптоми. Но в част от случаите, тези инфекции водят до отслабване на черния дроб или рак на черния дроб, смъртоносни усложнения, които всяка година убиват повече от 1 милион души по света. Sugano и колеги (1982) показаха, че инжекции с LEM от Lentinus edode забавят растежа на раковия чернодробен тумор в плъхове. Полизахаридна фракция от гъба Шиитаке демонстрира чернодробно защитно действие при животни, както и способност да подобри функцията на черния дроб и да засили производството на антитела към хепатит В. Лентинан показа благоприятни резултати при лечение на хроничен упорит хепатит и вирусен хепатит В. Четиридесет пациенти с хроничен вирусен хепатит В и серопозитивни за HBe antigenemia получаваха 6 грама LEM на ден (орално) в продължение на четири месеца. Изследването се концентрира върху броя на пациентите, серопревръщащи се от HBe анти-ген положителни към анти-HBe положителни, който беше 25% след LEM терапия, и по-висок при пациенти с хроничен активен хепатит (36.8%). В допълнение, 17 пациенти (43%) станаха сероотрицателни за HBe антиген. Тестовете на функцията на черния дроб се подобриха дори при пациенти, които останаха серопозитивни, те имаха повишен плазмен албумин и регулиран протеинов метаболизъм. В комбинация с полизахариди от гъба Рейши (Ganoderma lucidum) и Turkey tails (Trametes versicolor), лентинан подобрява SGPT и напълно GPT нива в черния дроб на мишки с токсичен хепатит. Груб екстракт от култури на гъба Шиитаке демонстрира чернодробни защитни действия. Гъбата Рейши показа благоприятни резултати при лечение на хепатит, особено в случаи без сериозни нарушения на чернодробните функции. В изследване на 355 случаи на хепатит В, третирани с Wulingdan хапче, което включва плодното тяло на гъба Рейши, 92.4% от пациентите имаха положителни резултати. В клиничен доклад на MARA Технологичен институт (Малайзия), замразено изсушен екстракт от гъба Рейши е полезен за облекчаване симптомите на пациенти, страдащи от хепатит В, чрез значително намаляване нивата на SGOT и SGPT и води до сероконверсия след три месеца администриране. Хепатозащитен ефект беше открит в екстракт от гъба Майтаке (Grifola frondosa), дадена на плъхове (300 мг/кг) в хепатитен модел (парацетамол-предизвикан). Полизахариден дериват от алкохолен екстракт на Dendropolyporus umbellatus демонстрира хепатозащитни ефекти при мишки. При 39 пациенти с цироза на черния дроб с асцити, които не отговориха на друго лечение, модифицирана традиционна билкова формула „Wu Ling San” с 2.3 г плодно тяло на D. umbellatus доведе до клинично излекуване при 17 случая, отбелязано подобрение при 7 и значително подобрение при 12. Шизофилан (SPG) от гъба Split Gill (Schizophyllum commune) показа (ин витро), че пациенти с хроничен хепатит В могат да се възползват от SPG, тъй като SPG може да засили имунологичната отзивчивост към вируса, особено при производството на интерферон-г. Фармакологичните действия, които могат да са резултат от протеинно свързан полизахарид (PSK) от гъба Turkey tails (Trametes versicolor), подкрепят чернодробната функция и показват възможно предпазване от рак на черния дроб. В Китай T. versicolor се смята полезна за хепатит В и хроничен активен хепатит. Полизахариди от Tremella fuciformis и екстракти от спори демонстрират чернодробно-защитни (р.о.) действия. Химично модифицираната форма на пачиман (вид полизахарид), карбоксилометилпачимаран от Wolfiporia cocos, предизвиква „незабавно излекуване” от хроничен вирусен хепатит при човешки клинични изследвания. Следвайки два курса на карбоксилометилпачимаран (60 мг, i.m.), не бяха открити странични ефекти и се наблюдаваше нормализиране на имунните функции. Използва се също за лечение на аритмия. Анти-диабетични ефекти Диабетът е една от най-старите известни болести в света. Днес приблизително 250 милиона души по света страдат от диабет. През последните години диабетът стана четвъртата водеща причина за смърт от болест в САЩ, например, и водещата причина за развитие на съпътстващи болести като болест на бъбреците, болест на кръвоносните съдове, слепота, импотентност и гангрена. В зависимост от природата на болестта, инсулин и определени синтетични лекарства като sulphonylureas, biguanidiness и acarbose са широко използвани при нейното лечение. През последните години, обаче, случаи на „инсулинова съпротива” и появата на странични ефекти при администриране на някои от традиционните лекарства предизвикаха търсене на безопасни и ефективни алтернативи. Няколко растения и гъбни екстракти и изолирани вещества бяха изследвани за анти-диабетично действие, с цел да се определят алтернативни стратегии за лечение на диабет. Гъбата Мейтаке или Hen-of-the-Woods (Grifola frondosa) има анти-диабетичен ефект. Тестове за толерантност към глюкоза бяха проведени при мишки, модел животни с NIDDM (захарен диабет, независещ от инсулин). Повишените нива на кръвна глюкоза след 15 мин и 30 мин при групата, хранена с майтаке, бяха 0.64 пъти и 0.76 пъти от тези на съответната контролна група, показвайки забавяне на значителното увеличение на кръвната глюкоза. След това беше изследвана инсулин рецепторната способност на чернодробните клетки, използвайки метод на чернодробна перфузия. Сред групата, хранена с майтаке, се забелязваше регулиране в посока надолу, докато при контролната група имаше състояние на толерантност. После беше изследвано действието на поглъщане на глюкозата при червата и действието на захараза при слузестата обвивка на тънките черва. Не се наблюдаваше нито забавяне на глюкозата в тънките черва, нито забавяне действието на захаразата с администриране на прах от Майтаке или Х-фракция. Тези резултати предположиха, че анти-диабетичното действие на Майтаке не е свързано със забавяне на поглъщането на глюкоза в червата, а с процеса на метаболизъм на погълната глюкоза. Хранейки генетично-диабетни плъхове с плодно тяло от майтаке (20% от диетата за 21 дни по 1 г/ден) също понижи нивата на кръвната глюкоза в модел на захарен диабет, независещ от инсулин. Ефектът на понижаване на кръвната глюкоза се приема за резултат от гликопротеин с високо (150,000) молекулно тегло от декокция с гореща вода и от съединения на етер-етанол екстракт. Gandoderan A и B, глюкани от плодното тяло на Ganoderma lucidum, значително намаляват нивата на плазмена захар при мишки. Кореолан (b-глюкан-протеин), получен от биомаса от потопена мицелна култура на Trametes versicolor, показа действие (при животни и ин витро тестове) срещу експериментален диабет.

Медицински гъби като източник на анти-туморни и имунно-модулиращи полизахариди

S.P. Wasser[1]

Резюме: На Земята съществуват 140 000 броя гъби, обаче само 10% са познати (приблизително 14 000 именувани сорта). Гъбите са голям и все още твърде неизползван източник на силни нови фармацевтични продукти. По-специално, и най-важно за съвременната медицина, те са неограничен източник на полизахариди с анти-туморни и имунно-стимулиращи свойства. Много, ако не и всички гъби Basidiomycetes съдържат биологично активни полизахариди в плодните тела, култивирани мицели, бульон. Събрани са данни за гъбните полизахариди от 651 сорта и 7 инфраспецифични таксони от 182 сорта higher Hetero- и Homobasidiomycetes. Тези полизахариди са с различен химичен състав, повечето спадащи към групата на β-глюкани; те имат β-(1→3) връзки в основната верига на глюкан и допълнителни β-(1→6) разклонени точки, необходими за анти-туморната им дейност. Глюканите с високо молекулно тегло изглежда са по-ефективни от онези с ниско молекулно тегло. Често се извършва химична модификация, за да се подобри анти-туморната дейност на полизахаридите и техните клинични качества (най-често водоразтворимост). Основните процедури, използвани за химично подобряване, са: разграждане на Смит (oxydo-reducto-hydrolysis), формолиза и карбоксиметилация. Повечето от клиничните данни за анти-туморното действие идват от търговските полизахариди лентинан, PSK (krestin), и schizophyllan, но полизахариди от някои други обещаващи сортове медицински гъби също показват добри резултати. Тяхното действие е особено полезно в клиниките, когато са използвани в комбинация с химиотерапия. Гъбните полизахариди предотвратяват онкогенезис, показват пряка анти-туморна действие срещу различни алогенни и сингенни тумори, и предпазват от туморни метастази. Гъбните полизахаридите не атакуват раковите клетки директно, а произвеждат анти-туморните си ефекти чрез активиране на различни имунни отговори в приемника. Анти-туморното действие на полизахаридите изисква непокътнат компонент на Т-клетка; тяхната дейност се предава през thymus-зависим имунен механизъм. Практичното приложение зависи не само от биологичните свойства, но също и от биотехнологичната наличност. Настоящият преглед анализира характерните свойства на полизахаридите, извлечени от плодните тела и мицела (двата основни метода на биотехнологично производство днес) в избрани примери на медицински гъби. Въведение Хилядолетия наред гъбите са били ценени от човечеството като хранителен и медицински източник. В много сортове гъби бяха открити някои биоактивни молекули, вкл. анти-туморни съставки. Полизахаридите са най-добре известните и най-силни гъбни съставки с анти-туморни и имунно-модулиращи свойства (Mizuno 1996, 1999a, b, 2002; Lorenzen and Anke 1998; Borchers et al. 1999; Ooi and Liu 1999; Wasser and Weis 1999; Tzianabos 2000; Reshetnikov et al. 2001). Исторически, разтворимите в гореща вода (декокции и есенции) фракции от медицински гъби, т.е. най-вече полизахариди, са използвани като лекарство в далечния Изток, откъдето основно произхождат познанията и практиката на използване на гъби (Hobbs 1995, 2000). Гъби като Ganoderma lucidum (Reishi), Lentinus edodes (Shiitake), Inonotus obliquus (Chaga) и много други са стотици години събирани и използвани в Корея, Китай, Япония и източна Русия. Тези практики все още са в основата на съвременните научни изследвания на медицинските действия на гъбите, особено в областта на рака на стомаха, простатната жлеза и белите дробове. Забележително и удивително е колко са надеждни фактите, събрани от традиционната източна медицина в изследването на медицинските гъби (Ying et al. 1987; Hobbs 1995, 2000; Wasser and Weis 1997a, b, 1999; Stamets 2000). Ikekawa et al. (1969) е публикувал един от първите научни доклади върху анти-туморните действия на есенции, добити от плодните тела на гъби, принадлежащи към семейство Polyporaceae (Aphyllophoromycetideae) и някои други семейства, проявени като вътрешно посредническо действие срещу присаден рак – като Сарком 180 – в животни (Ikekawa et al. 1982, 1992; Ikekawa 2001). Скоро след това са развити първите три основни медикамента от медицински гъби. И трите бяха полизахариди, по-специално β-глюкани: krestin от култивирана мицелна биомаса на Trametes versicolor (Turkwey Tail), лентинан от плодните тела на L. Edodes (Shiitake), и schizophyllan от течно култивирания бульон от Schizophyllum com­mune (Split Gill). През последните почти 40 години медицинските гъби са интензивно изследвани за медицински ефекти в модели на системи ин виво и ин витро, а много нови анти-туморни и имунно-модулиращи полизахариди бяха открити и използвани в практиката (Mizuno 1996, 1999a; Wasser and Weis 1999; Ikekawa 2001). Биологично активните полизахариди са широкоразпространени сред гъби higher Basidiomycetes, а повечето от тях имат уникални структури в различни сортове. Нещо повече, различни щамове на един и същи сорт Basidiomycetes могат да произведат полизахариди с различни свойства. Например, протеоглюкан krestin е разработен в Япония от щама Trametes (Coriolus) versicolor CM-101, а полизахарид-пептид (PSP) в Китай е разработен в потопена култура на щама Cov-1 от същия сорт. И двата протеоглюкана имат същия полизахариден компонент, но с различни протеинови молекули към полизахарида (Hiroshi and Takeda 1993). Настоящата статия анализира анти-туморните и имунно-модулиращи полизахариди от гъби higher Basidiomycetes. Отделено е повече внимание на общите им черти, отколкото на специфичните им характеристики. Статията резюмира общото състояние на познанията в областта на биоразнообразието на гъби и техните полизахариди; химическата структура на полизахаридите и връзката й с тяхната анти-туморна дейност, вкл. възможни начини на химична модификация; резултати от експериментални тестове и клинично използване на анти-туморни и имунно-стимулиращи полизахариди; възможни механизми на биологичното им действие; и накрая, разликата в състава на полизахаридната фракция при плодните тела и чиста култура мицел в избрани примери на изследваните медицински гъби. Голямото количество и разнообразие на гъби с анти-туморни полизахариди Общият брой на описаните фунги от всички видове в момента е поне 80 060 сорта; това е число, получено като сбор на броя на сортовете във всеки род, дадени в последното издание на Речник на фунгите (Kirk et al. 2001). Това число включва всички организми, традиционно изучавани от микологистите: тинеста плесен, chromistan фунги, chytridiaceous фунги, лишейни фунги, нишковидни фунги, плесени и закваски. Терминът „гъби” обикновено означава определението на Chang and Miles (1992): „макрофунга с характерно плодно тяло, което може да е или хипогенно, или епигенно, достатъчно голямо да се види с просто око и да се пипне с ръка”. Броят на нишковидните фунги, които са гъби в смисъла на това определение, извлечен от Речника на фунгите, е поне 14 000, а може даже 22 000 (Hawksworth 2001). Реалният брой на тези сортове на Земята, обаче, без съмнение е много по-висок. Двете основни причини за много по-големия реален брой са: (1) големият брой все още неизследвани сортове, и (2) фактът, че толкова много морфологично определени „сортове” гъби се оказват групи от няколко биологични сортове (Hawksworth 2001). Повечето нови гъби са открити в тропиците, по-специално онези сортове, които формират ectomycorrhizas с местните дървета. В различните тропически области 22-55% (в някои случаи до 73%) от сортовете гъби са неописани (Hawksworth 2001). Анализ на местностите, където новите за науката фунги са описани и каталогизирани в Индекса на фунгите през 10-те години от 1990 до 1999г., разкри, че около 60% от всички новоописани фунги са от тропиците (Hawksworth 1993, 2001); такъв е случаят също за гъби, въпреки че нови сортове продължават да се откриват в Европа и Северна Америка. Изследвания на съвместимостта и молекулните поредици между гъбите, смятани преди от един и същи сорт по морфологични причини, разкриха „тайни сортове”, например популации, функциониращи като отделни биологични сортове, но определени с едно научно име. Отделен морфологично определен сорт може да съдържа 20 или повече биологични сорта (Hawksworth 2001). Имайки предвид всичко това, скорошни изчисления на броя на фунгите на Земята варира от 500 000 до 9.9 млн. сорта, само 80 060 от които имат имена. Обикновено се приема работно число от 1.5 млн. сорта, а нови данни показват, че това не е безразсъдно. Броят на гъбите на Земята се определя на 140 000, от които може би само 10% са известни. В същото време от тези приблизително 14 000 сорта, известни днес, около 50% са смятани за притежаващи различни степени на ядливост, повече от 2 000 са безопасни, а около 700 сорта притежават значителни фармакологични свойства (Chang 1999; Wasser and Weis 1999; Reshetnikov et al. 2001). Следователно, очевидно е, че гъбите представляват огромен и в същото време все още неизследван източник на мощни нови фармацевтични продукти. Higher Basidiomycetes гъби са неограничен източник на анти-туморни и имунно-стимулиращи полизахариди. Всички основни таксономични групи гъби са били изследвани за биологично активни полизахариди, и повечето от тях притежават тези съставки. Поне 651 сорта и 7 инфраспецифични таксони, представящи 182 рода Hetero- и Homobasidiomycetes гъби съдържат анти-туморни и имунно-стимулиращи полизахариди, както се вижда от табл. 1, Приложение 1 (адаптирана от Reshetnikov et al. 2001). Естествено събрани или изкуствено отгледани плодни тела, чисти мицелни култури, и филтратни култури (бульонни култури), всички те съдържат биологично активни полизахариди. Процедури по пречистване на полизахаридите След две десетилетия интензивни изследвания на медицинските гъби Mizuno и колегите му от Япония разработиха надеждни процедури за успешна екстракция, фракциониране и пречистване на полизахариди от плодните тела или мицелни култури. По принцип тази схема включва елиминиране на съставките с ниски молекулни тегла от гъбния материал, използвайки 80% етанол, следвано от три успешни екстракции с вода (100°C, 3 ч.), 2% амониев оксалат (100°C, 6 ч.), и 5% натриев хидроксид (80°C, 6 ч.) (Mizuno 1996, 1999a). Резултатите от първата екстракция са водоразтворими полизахариди, а от другите две – водонеразтворими полизахариди. Извлечените полизахариди са по-нататък пречистени чрез комбинация от техники, като етанолова концентрация, фракционно утаяване, киселинно утаяване, йоннообменна хроматография, гелова филтрация, и афинитетна хроматография. По принцип, йоннообменната хроматография чрез DEAE-целулозни колони разделя неутралните полизахариди от киселинните. Тогава неутралните полизахариди са разделени на α-глюкани (погълната фракция) и β-глюкани (непогълната фракция) с помощта на гелова филтрация и афинитетна хроматография. Същата процедура с киселинните полизахариди (след извличане с 1 M NaCl) води до пречистени полизахариди (Mizuno 1999a). Основните схеми за фракционни препарати на полизахариди от гъби са показани схематично на фиг. 1, Приложение 2. Трябва да се отбележи, че всяка схема на процедурата на фракциониране зависи във всеки случай от полизахаридния състав на извлечения материал. Структурен състав на анти-туморните полизахариди в гъбите Полизахаридите принадлежат към структурно разнообразни макромолекули, полимери на монозахаридни остатъци, обединени помежду си чрез гликозни връзки. Заслужава си да се отбележи, че в сравнение с други биополимери, като протеини и нуклеидни киселини, полизахаридите предлагат по-голям капацитет на пренасяне на биологична информация, защото имат най-голям потенциал за структурно разнообразие. Нуклеотидите в нуклеидните киселини и аминокиселините в протеините могат да се свързват само по един начин, докато монозахаридните единици в полизахаридите могат да се свързват в различни точки, за да формират широко разнообразие от клонирани или линейни структури (Sharon and Lis 1993). Това огромно потенциално разнообразие в полизахаридната структура дава необходимата гъвкавост за прецизните регулиращи механизми на различни взаимодействия клетка-клетка в по-висшите организми. Гъбните полизахариди присъстват най-вече като глюкани с различни видове гликозни връзки, като (1→3), (1→6)-β-глюкани и (1→3)-α-глюкани, но някои са изцяло хетерогликани. Другите в повечето случаи се свързват с протеинови остатъци като PSP комплекси (PSPC; Gorin and Barreto-Berger 1983). Основният източник на анти-туморни полизахариди изглежда са стени на фунгова клетка, състоящи се от полизахариди. Обаче хитин и хитозан (fungal chitin) нямат анти-туморно действие (Mizuno et al. 1995b). β-D-глюканът е полизахарид, произвеждан основно от D-глюкоза чрез киселинна хидролиза (Mizuno 1996, 1999a). Колкото до структурата на третичния строеж на schizophyllan, активен β-D-глюкан има тройно-нишкова дясно-спираловидна структура (Marchessault et al. 1977). Acidic glucuronoxylomannan, изолиран от плодното тяло на Tremella fucifor­mis, също има ляво ориентирана, тройно-спираловидна гръбначна форма (Yui et al. 1995). Освен добре познатите анти-туморни β-(1→3)-глюкани, широк кръг биологично активни глюкани с други структури са описани. Тези полизахариди имат линейни или разклонени молекули в гръбнака, съставени от α- или β-свързани единици глюкоза, и съдържат странични вериги, прикрепени по различни начини. Хетероглюкан странични вериги съдържат глюкозна киселина, ксилоза, галактоза, маноза, арабиноза, или рибоза като основен компонент или в различни комбинации. Изследвани са широк кръг анти-туморни или имунно-стимулиращи полизахариди с различна химична структура от Висшите Базидиомицети; основните видове са представени на табл. 2, Приложение 1. Броят на анти-туморните активни фракции в плодните тела на гъбите е забележително висок. Един пример може да се види в анализ на полизахариди на плодни тела на Pleurotus pulmonarius (= P. sajor-caju): 16 полизахаридни фракции от 21 екстракции показаха различни нива на анти-туморно действие (Zhuang et al. 1993, табл. 3, Приложение 1). Най-активните анти-туморни водоразтворими фракции от P. pulmonarius са Fi_o-a протеин-съдържащ ксилоглюкан с Man:Gal:Xyl:Glc в полизахарида при моларно съотношение 2:12:42:42, а FA-2 протеин-съдържащ манногалактан с Xyl:Man:Gal (9:35:56 моларно съотношение). Най-активните анти-туморни водонеразтворими полизахариди са FII-1 протеин-съдържащ ксилан; FIII-1a протеин-съдържащ глюкоксилан с Glc:Xyl (40:44 моларно съотношение), и FIII-2a протеин-съдържащ ксилоглюкан с Xyl:Glc (36:62 моларно съотношение). Корелация на структурата и анти-туморните действия на гъбните полизахариди Полизахаридите с анти-туморно действие се различават много по своя химически състав и конфигурация, както и по своите физически свойства. Анти-туморното действие се показва чрез широк кръг от гликани, варирайки от хомополимери до много сложни хетерополимери (Ooi and Liu 1999). Разликите в свойствата могат да бъдат съпоставени с разтворимостта във вода, размера на молекулите, степен и форма на разклоняване. Въпреки че е трудно да се съпостави структурата и анти-туморното действие на сложните полизахариди, могат да се направят някои връзки. Очевидно е, че за анти-туморното действие са необходими структурни характеристики като β-(1→3) връзки в основната верига на глюкан и допълнителни β-(1→6) разклонени точки. β-глюканите, съдържащи основно (1→6) връзки, имат по-слабо действие. Изглежда глюканите с високо молекулно тегло са по-ефективни от тези с ниско молекулно тегло (Mizuno 1996, 1999a, b). Наблюдават се също обаче очевидни различия в анти-туморните полизахариди. Анти-туморните полизахариди могат да имат други химични структури, например хетеро-β-глюкани (Mizuno et al. 1995b), хетерогликан (Gao et al. 1996b), β-глюкан-протеин (Kawagishi et al. 1990), α-мано-β-глюкан (Mizuno et al. 1995b), α-глюкан-протеин (Mizuno et al. 1995b) и хетерогликанпротеин комплекси (Zhuang et al. 1993; Mizuno et al. 1996). Известно е, че β-(1→3)-глюкани на медицинските гъби с тройно-спираловидното третично устройство са важни за имунно-стимулиращото им свойство. Когато лентинан беше денатуриран с диметил сулфоксид, урея, или натриев хидроксид, третичната структура се изгуби, докато основната структура не се повлия, но свойствата на задържане на тумора бяха намалени с прогресивна денатурация (Maeda et al. 1988). Същите резултати, потвърждаващи корелацията между анти-туморното действие и тройно-спираловидната структура, бяха получени при изследване на schizophyllan (Yanaki et al. 1983, 1986). Гъбните β-(1→3)-глюкани показват много биологични и имунно-фармакологични действия, много от които, като макрофаг азотен оксид синтез, и limulus factor G активиране, са зависими от тройно-спираловидното устройство, докато други не са зависими от него, например синтез на интерферон-γ и фактор на стимулиране на колония (Yadomae 2000), показвайки, че α-(1→3)-манната гръбначна структура е по-важна от третичната структура на молекулата. За разлика от β-(1→3)-глюкани с медицински свойства, които са силно зависими от високо молекулно тегло от 500 до 2,000 kDa (Mizuno 1996), α-(1→3)glucuronoxylomannans, характерни за желираните гъби, не са силно зависими от молекулното тегло. По този начин Gao и колегите му (1996a) докладваха, че киселинни хидролизатни фракции на плодните тела на T. fuciformis съдържат glucuronoxylomannans с молекулни тегла от 53 до 1 kDa, които карат човешките моноцити да произвеждат интерлеикин-6 толкова ефикасно, колкото нехидролизиран хетерополизахарид. Това показва, че действието може да се дължи на общата структура на α-(1→3)-манния гръбнак; разликите в молекулното тегло нямат видно въздействие върху действието на хетерогликани (Gao et al. 1996b). Активиране на гъбните полизахариди чрез химична модификация В литературата са описани различни методи за подобряване анти-туморното действие на гъбните полизахариди чрез химична модификация. Най-успешните схеми за химично подобряване на гъбните полизахариди са разработени за Ganoderma lucidum (Reishi), Grifola frondosa (Maitake) and Leucopaxillus giganteus (= Tricholoma gigantea). Тези схеми включват две основни процедури: модификация на гъбните полизахариди чрез разграждане на Смит (oxydo-reducto-hydrolysis) и активиране чрез метода на формолизата (Mizuno 1996, 1999a; Mizuno et al. 1996). По метода на разграждане на Смит бяха подготвени пет полиалдехиди и десет полиалкохоли от пет полизахаридни фракции, преди това добити от течна мицелна култура на G. Frondosa (Maitake). По тази причина оригиналните полизахаридни разтвори бяха първо оксидирани чрез полиалдехиди 0.1 M NaIO₄ на тъмно, после превърнати в полиалкохоли чрез намаляване на NaBH₄ в алкална среда, нагласена за pH 8 с 2 M NaOH, и хидролизирана с 1 M H₂SO₄ на стайна температура (Zhuang et al. 1994b). Химичното активиране на гъбни полизахариди по метода на формолизата включва разграждане на полизахаридите чрез мравчена киселина в 99% HCOOH разтвор; тогава реагиралият разтвор се утаява с 99% EtOH, и половината от утайката е лиофилизирана след диализа, докато другата половина е разтворена в гореща вода и допълнителни фракции, получени от алкохолно утаяване (Zhuang et al. 1994b). По този метод бяха подготвени четири формилирани полизахариди и четири полизахаридни продукта на формолиза от четири полизахаридни фракции от течна мицелна култура на G. frondosa. Въпреки че два от оригиналните полизахарида нямаха никакво действие, техният полиалдехид полиол, формилирани и формолизирани производни, показаха значително действие. Полиалдехид и полиол-полизахариди, приготвени от полизахарид с ниско анти-туморно действие, показаха по-високо действие от оригиналния полизахарид (Zhuang et al. 1994b). Тъй като всички оригинални полизахаридни фракции, показващи повишени нива на действие чрез химична модификация, бяха β-глюкан или ксилоглюкан, беше предположено, че захарната верига се е променила или е била премахната при третирането, давайки резултат в подобрена разтворимост и действие (Mizuno 1999a). Карбоксиметилация е другият химичен метод, използван за трансформиране на β-глюкани във водоразтворима форма. Например, цели плодни тела на Pleurotus ostreatus или техни парчета бяха третирани с разтвор на 0.15 M натриев хидроксид при 95°C за 2 ч. Събраният остатък беше измит с вода докато стане неутрален, след това суспендиран в разтвор от 0.06% натриев хлорит, нагласен на pH 4.5 с мравчена киселина, и разбъркан за 6 ч. при 50°C. Полученият полизахарид беше β-(1→3)-свързан глюкан, а всеки четвърти глюкопираносил остатък заместен с 0–6 с единични D-глюкопираносил групи. Хетерогенната етерификация на прахообразния глюкан с монохлорооцетна киселина (C₂H₃ClO₂) в алкална среда даде натриева сол на производно на водоразтворим O-(карбоксиметил) глюкан (Kuniak et al. 1993; Karácsonyi and Kuniak 1994). Карбоксиметилираният глюкан от Pleurotus ostreatus (pleuran) показа имунно-модулиращи ефекти, особено засилено фагоцитно действие (Paulik et al. 1996). По същия начин водонеразтворим алкалноразтворим линеен α-(1→3)-глюкан, получен от плодните тела на Amanita muscaria и Agrocybe aegerita, имаше малък или никакъв ефект, докато техните карбоксиметилирани продукти показаха потенциално анти-туморно действие (Kiho et al. 1994; Yoshida et al. 1996). Химична модификация на разклонени гъбни полизахариди, водещи до намаление на страничната верига, могат да се получат не само чрез разграждане на Смит, а също и чрез ензимни реакции. След успешни ензимни третирания на потопена течна култура с амилаза, целулоза и протеаза, беше получен нов линеен полизахарид, съдържащ α-(1→4)-свързани α-D-глюкозни единици с молекулни тегла от 500–10,000 kDa (Kosuna 1998). Линейни α-(1→4)-глюкани с ниско молекулно тегло, получени след ензимно намаляване на страничните вериги и протеинов компонент (активни хексозо-свързани съединения (active hexose correlated compounds – AHCC)) показаха, че имат имунно-модулиращи и анти-туморни свойства (Ghoneum et al. 1995; Matsushita et al. 1998). През 1992г. в Япония беше направен опит да се увеличи профилактичния ефект на AHCC срещу повторна поява на хепатоклетъчен карцином след хирургична намеса (Kidd 2000). Сулфатираните хомо- и хетерополизахариди, притежаващи антивирусно действие, са широкоразпространени в algae, особено в морско algae (Schaeffer and Krylov 2000), но не се срещат в природата в гъби higher Basidiomycetes. Химично сулфатираните schizophyllans с различно съдържание на сяра бяха получени от β-(1→3)-глюкан, произведен от Schizophyllum commune (Itoh et al. 1990; Hirata et al. 1994). Беше предположено, че съдържанието на сяра в schizophyllan е по-важно за задържане растежа на вируса на имунната недостатъчност (HIV), отколкото молекулното тегло или природата на захарния компонент (Itoh et al. 1990; Hobbs 1995). Медицинските тестове показват, че сулфатираният schizophyllan със сярно съдържание 5% може да се използва като анти-HIV агент за третиране на хемофилици, заразени с HIV (Hirata et al. 1994; Hobbs 1995). Важно е да се разбере, че химичната модификация е необходима в много случаи, за да подобри не само анти-туморното действие на гъбните полизахариди, а също и клиничните им качества, най-важните от които са водоразтворимост и възможност за проникване през стомашните стени след орално поглъщане. Тестване на анти-туморното и имунно-модулиращо действие на гъбните полизахариди Първоначалните данни за анти-туморното действие на гъбните екстракти бяха косвени и по никакъв начин стабилни и надеждни. В същото време много косвени данни, които бяха правилно събрани и обработени, дадоха добри доказателства за полезните ефекти на гъбите върху човешкото здраве. Добър пример е епидемилогичното изследване в префектура Нагано, Япония, където действието беше наблюдавано за няколко десетилетия. Изследователите показаха, че раковата смъртност на фермери, отглеждащи Flammulina velutipes (добре известна медицинска гъба в Япония), беше забележително по-ниска от тази на останалото население в префектурата (Ikekawa 1995, 2001). Друго подобно наблюдение в Бразилия предизвика обширни изследвания – и популярност – на Agaricus blazei (вж. по-долу). Бих искал да подчертая принципните моменти на анти-туморните и имунно-модулиращите ефекти на гъбните полизахариди. Най-важните от тях са: (1) предпазване от онкогенезис чрез орално приемане на гъби или техни препарати; (2) пряко анти-туморно действие срещу различни алогенни и сингенни тумори; (3) имунно-засилващо действие срещу тумори в комбинация с химиотерапия; (4) предпазен ефект при туморни метастази. Японски изследователи дават добър пример за предпазния ефект на тяхната известна ядлива и медицинска гъба Hypsizygus marmoreus (Ikekawa 2001). Контролни мишки бяха хранени на обикновена диета, а третирани мишки – с диета, съдържаща 5% сухо плодно тяло на H. marmoreus. Всички мишки бяха интраперитонално инжектирани със силен карциноген, метилхлорантрен, а карциногенезисът беше изследван. На края на 76-та седмица от наблюдението 21 от 36 контролни мишки развиха тумори, а от третираната група – само 3 от 36 мишки. Авторите заключиха, че механизмът на действие на ядливите гъби да задържат рака и предпазват от рак се дължи на имунно засилване (Ikekawa 2001). Добре известно е от клиничната практика, че гъбните полизахариди работят най-добре заедно с други форми на „тежка” химиотерапия и операция, които за съжаление са много агресивни и имат много отрицателни странични ефекти. В това отношение върху животински модели и в човешката клинична практика най-добре е изследван лентинанът. При едно изследване 275 пациенти с напреднал или повтарящ се стомашен рак бяха третирани с една от два вида химиотерапия (митомицин C с 5-флуороурацил или тегафур) или самостоятелно, или с инжекции лентинан. Най-добрите резултати бяха получени, когато лентинан беше администриран преди химиотерапията и при пациенти с първично поражение, които не са преминали през предишни химиотерапии. Резултатите бяха оценени въз основа продължителност на живот, регресия на туморите или пораженията, и подобряване на имунните отговори (Hamuro and Chihara 1985; Hobbs 1995; Wasser and Weis 1997a). Метастазът е много сериозен и важен проблем в терапията на рака. Профилактичният ефект на гъбните екстракти върху раков метастаз бяха изследвани от много групи, особено в Националния изследователски институт с раков център в Япония. В поредица от успешни експерименти Lewis белодробен карцином беше Schwann-клетъчно трансплантиран във възглавничките на лапите на мишките и EA6 или EA6-PII (полизахариди от Flammulina velutipes) бяха следоперационно администрирани за период от 10 дни. Продължителността на живот на групата, третирана с EA6-PII, беше значително удължена (Ikekawa 2001). По-нататъшно изследване беше проведено с Meth-A фибросарком: 7 дни след като туморът беше Schwann-клетъчно трансплантиран в корема на женски BALB/c мишки, плътният тумор от всяка мишка беше хирургично изваден, а 7 дни след операцията беше направен втори опит със същия тумор, Meth-A фибросарком, като беше Schwann-клетъчно трансплантиран в другата страна на корема на мишката, и растежът на тумора от повторния опит беше изследван. Резултатите показаха, че предварителното третиране с EA6 леко задържа растежа на повторния тумор, но пост-третирането беше забележително ефективно за задържане растежа на тумора при доза 10 mg/kg (Ikekawa 2001). Бяха извършени много тестове на специфични препарати от определени гъби върху животински модели и в клиники. След като Chihara изолира лентинан от Lentinus edodes през 1969 г., повечето от експерименталното анти-туморно тестване беше извършено с този полизахарид. Неговият баща, самият Chihara, беше един от първите изследователи, които обявиха анти-туморните свойства на лентинана. Първоначално неговият ефект беше тестван използвайки Сарком 180, имплантиран в CD-1/ICD мишки (Chihara et al. 1969, 1970). По-късно лентинан показа очевидно анти-туморно действие не само срещу алогенни тумори, а също и срещу различни сингенни и автохтонни тумори (Hamuro and Chihara 1985). Инжекции лентинан върху мишки доведоха до 80% намаление на туморния размер или пълна регресия в повечето тествани животни (Chihara 1981). Последваха много клинични тестове. Един от първите такива беше продължително, произволно контролно изследване на пациенти във Фаза 3 на напреднал или повторен рак на стомаха (Wasser and Weis 1999; Ikekawa 2001). Терапията с лентинан показа много добри резултати в удължаване продължителността на живот на пациентите и нямаше токсични странични ефекти. Подобни резултати бяха получени при пациенти с колоректален рак и рак на гърдата. Оттогава лентинан се превърна в широкоизползвано лекарство и хранителна добавка в Япония, други страни в Далечния Изток, а по-късно в САЩ и Европа. PSK (търговско име krestin) има забележително имунно-засилващо действие и широк антинеопластичен обхват. Той удължава времето на оцеляване на облъчени мишки, стимулира фагоцитозното действие на макрофагите, и подобрява функциите на ретикулоендотелната система (Zhu 1987). Що се отнася до анти-туморните му свойства, той действа пряко на туморните клетки, както и косвено в приемника, засилвайки клетъчния имунитет (Hobbs 1995; Stamets 2000). Той е показал анти-туморно действие в животни с аденосарком, фибросарком, мастоцитома, плазмацитома, меланома, сарком, карцином, и рак на гърдата, дебелото черво и белия дроб (Sugimachi et al. 1997). Интересна черта на това съединение е, че инжекция с PSK в един туморен обект задържа туморното развитие в други обекти, така предпазвайки от метастази. PSK е използван орално и интравенозно в клиничната медицина. Той се оказа ефективен срещу много видове рак (Hobbs 1995; Stamets 2000), но рядко със задоволителни резултати, ако се прилага самостоятелно. Полизахаридът schizophyllan показва анти-туморно действие срещу плътни и ascite форми на Сарком 180, както и срещу плътната форма само на Сарком 37, Erlich сарком, Yoshida сарком и Lewis белодробен карцином (Hobbs 1995). Schizophyllan засилва клетъчния имунитет чрез възстановяване на подтиснатото действие на убиване на клетки до нормални нива в мишки с тумори (Borchers et al. 1999). Най-добрите резултати срещу поражение от облъчване бяха открити, когато schizophyllan беше прилаган скоро след или заедно с облъчването, а schizophyllan възстанови митозата на клетките на костния мозък, подтиснати от антираковите лекарства (Zhu 1987). Клиничните изследвания върху хора показаха полезното действие на лечението с schizophyllan за пациенти с повторен и неоперируем рак на стомаха, етап 2 шиен рак, и напреднал шиен карцином (Hobbs 1995). Механизми на анти-туморно и имунно-модулиращо действие с гъбни полизахариди Гъбните полизахариди проявяват анти-туморното си действие предимно чрез активиране на имунния отговор на организма на приемника. Тези съставки са смятани за модификатори на биологичния отговор (biological response modifiers – BRMs; Wasser and Weis 1999). Това основно означава, че те: (1) не предизвикват вреда и не поставят допълнителен стрес върху тялото; (2) помагат на тялото да се адаптира към различни биологични и други стресове, присъщи на средата; и (3) прилагат неспецифично действие върху тялото, поддържайки някои или всички основни системи, вкл. нервна, хормонална и имунна система, както и регулиращите функции (Brekhman 1980). Имунно-модулиращото действие на гъбните полизахариди е особено ценно като профилактична, лека и неагресивна форма на лечение, както и при профилактика от метастазни тумори, и др., описани по-горе. Полизахаридите от гъби не атакуват пряко раковите клетки, а произвеждат техни анти-туморни ефекти чрез активиране на различни имунни отговори в приемника. Това беше доказано в много експерименти, например загубата на анти-туморния ефект на полизахариди в неонатални thymectomized мишки или след администриране на анти-лимфоцитен серум (Ooi and Liu 1999). Тези резултати предполагат, че анти-туморното действие на полизахаридите изисква незасегнат компонент на T-клетка, и че действието се предава чрез имунен механизъм, зависещ от тимуса. Освен това, анти-туморното действие на лентинана и други полизахариди е забавено чрез предварително третиране с антимакрофагни агенти (като карагенан). Така че, смята се, че различните ефекти на полизахаридите се дължат на засилване на отговора на предшестващи Т-клетки и макрофаги към цитокини, произведени от лимфоцити след специфично разпознаване на туморните клетки (Hamuro and Chihara 1985). Като допълнение, въвеждането на подчертано увеличение в количествата на CSF, IL-1, и IL-3 от полизахариди водят до узряване, разграничаване и разпространение на имунно-способните клетки за защитни механизми на приемника (Hamuro and Chihara 1985). Гъбните полизахариди са известни като стимулатори на естествените клетки убийци, Т-клетки, В-клетки, и отговорите на имунната система, зависима от макрофаги. Лентинан е известен с възможността си да възстановява подтиснатата дейност на помагащите Т-клетки в приемника, притежаващ тумор, до нормалното им състояние, водещо до пълно възстановяване на хуморални имунни отговори (Ooi and Liu 1999). Същият ефект важи за PSK, докато той няма съществени ефекти върху имунните отговори в приемника при нормални условия. Инфилтрацията на еозинофили, неутрофили и гранулоцити около целевите тъкани също се засилва от лентинан. Той активира отделянето на активен кислород и производството на цитокини в перитонеалните макрофаги. Лентинан увеличава също цитотоксичността на перитонеалните макрофаги срещу метастазни тумори; той може да активира нормалните и алтернативни пътеки на допълнителната система и може да раздели C3 на C3a и C3b, засилвайки активирането на макрофаги (Aoki 1984; Wasser and Weis 1997a; Hobbs 2000). Имунно-активиращата способност на лентинана може да се свърже с неговата модулация на хормонални фактори, които играят роля в туморния растеж. Aoki (1984) показа, че анти-туморното действие на лентинана е силно намалено с администриране на тироксин или хидрокортизон. Лентинанът може също да възстанови специфичната за тумора анти-ген ориентирана реакция на хиперчувствителност от забавен тип. Schizophyllan активира макрофагите (ин витро и ин виво), което води до засилване действията на Т-клетките и увеличава чувствителността на цитотоксични LAK и NK клетки към IL-2 (Mizuno 1996). Въпреки че е структурно свързан с лентинана, schizophyllan не активира пряко Т-клетките (Hobbs 1995). Възможните пътеки на такива действия на лентинана са описани в Chihara (1981) и Hamuro and Chihara (1985), и прегледани от Wasser and Weis (1999), а тези за β-D-глюкан BRMs (Mizuno 2002) са показани на фиг. 2 и фиг. 3, Приложение 2. Избрани примери на важни медицински гъби с анти-туморни полизахариди в плодните тела и култивирания мицел Нашата група изследва един от най-важните ядливи и медицински биотехнологични сорта, известен като A. blazei. Анализът на данните за култивираната гъба, произхождаща от Бразилия, и изследването на типов материал от A. blazei Murrill показват драматични разлики между тях. На основата на съществуващи различия беше предложено правилното име на ширококултивираната гъба да бъде нов за науката сорт Agaricus brasiliensis (S. Wasser et al). A. blazei е северно-американският ендемичен некултивиран сорт, известен само от три местности – една във Флорида и две в Южна Каролина (Wasser et al. 2002). Гъбата Agaricus blazei (the Royal Sun Agaricus, ABM, Himematsutake, Cogmelo de Dues) е една от по-новооткритите медицински гъби. Вкусната ядлива гъба произхожда от много малка област в планините на Бразилия, близо до град Сан Пауло. Епидемиолозите, изучаващи местното население в тази област, откриха, че те имат много малко случаи на болестно разнообразие, вкл. рак, както и вирусни и бактериални болести, а непропорционално голям брой от тях се радват на дълголетие. В последствие това беше свързано с постоянното консумиране на гъбата A. blazei в нормалното хранене. През 80-те и 90-те години на ХХ век A. blazei показа, че е стимулант на имунната система, карайки естествените защитни механизми на тялото да се борят с много инфекциозни агенти и условия, например рак. Имунно-стимулиращото и анти-туморно действие на екстрактите от A. blazei беше изследвано в различни лабораторни модели, включващи мишки, носещи тумори на Сарком 180 и (Meth-A) фибросарком (Kawagishi et al. 1989, 1990; Mizuno et al. 1990b, 1998; Mizuno 2002; Itoh et al. 1994; Ebina and Fujimiya 1998; Fujimiya et al. 1998a, 2000; Stamets 2000). От 17 полизахаридни фракции, получени от плодните тела на A. blazei (Mizuno et al. 1990a; Mizuno 2002), 7 показаха анти-туморно действие. Анализите на физико-химичните свойства на водоразтворимите полизахаридни фракции с високо анти-туморно действие показаха, че техните основни компоненти бяха β-(1→6)-; β-(1→3)-глюкан, acidic β-(1→6)-; α-(1→4)глюкан, и acidic β-(1→6)-; α-(1→3)-глюкан (Mizuno et al. 1990a). A. blazei беше първата гъба, описана, че съдържа анти-туморен глюкан с β-(1→6)-свързан гръбнак, за разлика от добре известните β-(1→3)-глюкани. Анти-туморният протеоглюкан HM3-G от плодните тела на A. blazei, който предизвиква активиране и апоптоза на естествени клетки убийци, има молекулно тегло 380 kDa и съдържа повече от 90% глюкоза, а основният компонент е α-(1→4)-глюкан с β-(1→6)-разклоняване, при съотношение приблизително 4:1 (Fujimiya et al. 1998b). Интересно е да се отбележи, че фракция с ниско молекулно тегло, LM-3, със средно тегло 20 kDa, съставена от α-(1→4)-глюкан с β-(1→6)-разклоняване, също демонстрираше туморно-специфични цитоубийствени и имунно-засилващи ефекти (Fujimiya et al. 1999), докато чист глюкан, получен от анти-туморен β-(1→6)-глюкан-протеин комплекс, изолиран от водонеразтворим остатък от плодни тела на A. blazei, не показа силно действие (Kawagishi et al. 1990). Три имунно-стимулиращи хетероглюкани (AG-2, -3, и -6) бяха получени с 0.9% натриев хлорид и гореща вода от плодните тела на A. blazei от шестте получени полизахариди (Cho et al. 1999). AG-2 и AG-3 съдържаха глюкоза, галактоза и маноза в морални съотношения съответно 74.0:15.3:10.7 и 63.6:17.6:12.7; а AG-6 се състоеше от глюкоза и рибоза в морално съотношение 81.4:12.6. Ксилоглюкан (Xyl:Glc, морално съотношение =2:10), съдържащ 9% протеин, получен чрез фракционизиране и пречистване на екстракт от A. blazei, показа съществено действие срещу Сарком 180 при мишки (Mizuno 2002). Не само плодните тела, а и култивираният мицел от A. blazei, са източник на анти-туморни полизахариди. Анти-туморна органична съставка, наречена ATOM, беше получена от A. blazei (Iwade strain 101), която е PSPC (Ito et al. 1997). Друг PSPC, 0041, беше получен от потопена мицелна култура; основните компоненти на този полизахарид са глюкоза и маноза (Hikichi et al. 1999). Наскоро беше отделен нов анти-туморен полизахарид срещу Сарком 180 от течен култивиран мицел на A. blazei: β-(1→2)-; β-(1→3)-глюкоманан (Tsuchida et al. 2001). Този полизахарид изглежда напълно различен от анти-туморните полизахариди от плодните тела на A. blazei (Mizuno et al. 1999b). Филтрат във водна среда, отделен от мицел след потопено култивиране на A. blazei, съдържаше манан-протеинов комплекс (AB-FP) с молекулно тегло 10⁵–10⁷ Da и малко количество глюкоза, галактоза и рибоза. Добивът на AB-FP беше 575 мг/1 филтрат във водна среда, и съдържа съществено анти-туморно действие (Mizuno 2002). Следователно, анти-туморните полизахариди, изследвани в плодното тяло на A. blazei, мицелни култури или произведени екстраклетъчно в културна среда, имат различни химични структури. Полизахаридите от плодните тела показаха глюкани с различни видове връзки на единици глюкоза или хетероглюкани; мицелните култури съдържаха глюкоманани, а манан-протеинови комплекс беше произведен в културна среда при потопено култивиране. Ganoderma tsugae е друга медицинска гъба, чиито полизахариди са добре изследвани и в плодното тяло, и в мицела. От 14 водоразтворими и 15 водонеразтворими фракции от плодните тела на G. tsugae, бяха получени 7 гликани със силни анти-туморни действия (Wang et al. 1993). Водоразтворимите фракции бяха протеин-съдържащи глюкогалактани, свързани с маноза и фукоза, а водонеразтворимите фракции представяха протеин-съдържащи β-(1→3)-глюкани с различно протеиново съдържание. От мицела на G. tsugae бяха получени 16 водоразтворими полизахариди и изследвани за анти-туморни ефекти върху Сарком 180 при мишки (Zhang et al. 1994b). Получените 3 активни полизахариди бяха: гликан-протеинов комплекс, съдържащ 9.3% протеин, с хетерополизахарид, съставен от маноза and ксилоза; a глюкан-протеинов комплекс, съдържащ 25.8% протеин; и гликан-протеин с глюкоза като основен компонент, и свързан с арабиноза, маноза, ксилоза и галактоза. Сравнение на активни водоразтворими полизахариди, получени от плодно тяло и мицел, показаха, че тези от плодното тяло бяха глюкогалактанпротеин комплекси, а тези от мицел бяха хомоглюкан-протеинови комплекси или хетерогликан, съставен от маноза и ксилоза. Grifola frondosa е една от най-популярните медицински гъби. Плодните тела на тази гъба съдържат β-(1→3)-; β-(1→6)-глюкан, acidic β-D-глюкан (Mizuno et al. 1986; Jong and Birmingham 1990; Wasser and Weis 1999), и β-(1→6)-; β-(1→3)-глюкан (Nanba et al. 1987) във водоразтворима полизахаридна фракция. Водонеразтворими фракции включват acidic ксилоглюкан с Glc:Xyl моларно съотношение 100:82 и 16.5% глюкуронова киселина; acidic хетерогликан, съдържащ 3.8% протеин, компонентна захар Glc:Xyl:Man:Fuc (100:58:34:14); и три acidic гликопротеини с молекулни маси 20–100 kDa. Основната компонентна захар е глюкоза, докато фукоза, ксилоза, маноза и галактоза са второстепенни компоненти (Mizuno et al. 1986). Следователно, всички полизахариди, открити в плодните тела на G. frondosa, са β-глюкани с различно устройство на веригата, хетероглюкани, или глукопротеини. За разлика от състава на полизахарида в плодното тяло, не са открити β-глюкан сред анти-туморните активни фракции, получени от културен мицел (отгледани върху Whatman филтърна хартия, напоена с течна хранителна среда), събран преди началото на плодните тела (Mizuno and Zhuang 1995). Във водоразтворимите фракции бяха открити фукогалактоманан-протеинов комплекс, глукогалактоманан, маногалактофукан, и галактоглукоманофукан-протеинов комплекс. Във водонеразтворими фракции бяха открити манофукоглукоксилан, маноглукофукоксиланпротеин комплекс, манофукоглукоксилан-протеинов комплекс, и глукоманофукоксилан-протеинов комплекс (Zhuang et al. 1994a). Следователно, полизахариди от G. frondosa са хетероманани, хетерофукани и хетероксилани, или техни комплекси с протеини, т.е. видове полизахариди, които не бяха намерени в плодните тела на тази гъба. Трябва да кажем, че полизахаридната структура в култивирания мицел може да зависи от структурата на хранителната среда, използвана за култивиране. Така Ohno и колеги (1985, 1986) стигнаха до извода, че анти-туморният глюкан грифолан, получен от култивиран мицел на G. frondosa, е β-(1→3)-, β-(1→6)-глюкан, същият като този в плодното тяло на гъбата. В този експеримент чиста култура беше отгледана в течна среда в стационарна култура или с клатене. Полученият мицел беше допълнително култивиран за 3 дни в buffer, състоящ се от глюкоза (5%) и лимонова киселина, pH 4.5. Анти-туморно активните β-(1→3)-, β-(1→6)-глюкани бяха получени чрез екстракция на мицел, отгледан в хранителна среда и чрез алкохолно утаяване на buffer supernatant (Adachi et al. 2002). Броят на полизахаридите, получени от плодни тела или култивиран мицел от същия сорт, зависи много от използвания метод на фракцинизиране, но по принцип общият брой на полизахаридите в плодните тела е по-висок (вж. табл. 4, Приложение 1). Броят на фракциите, показани на табл. 4, включва в някои случаи не само окончателно пречистени полизахариди, а и някои междинни фракции, които бяха тествани за анти-туморно действие. Съотношението на биологично активни полизахаридни фракции в плодни тела и култивиран мицел е много високо. Така 20 от 29 полизахаридни фракции, получени от плодното тяло на G. frondosa, показаха различни нива на анти-туморно действие (Mizuno et al. 1986), а 24 от 29 полизахаридни фракции, получени от култивиран мицел на същата гъба, показаха анти-туморно действие (Zhuang et al. 1994a). Общият брой на полизахаридите, получени от плодното тяло, по принцип е по-висок от тези, получени от култивиран мицел. Например, общо водоразтворимите и водонеразтворими полизахариди, получени от склеротум на I. obliquus, са 2-3 пъти повече от тези, получени от култивиран мицел (вж. табл. 5, Приложение 1). Заключение Higher Basidiomycetes гъби са все още далеч недостатъчно изследвани; дори списъкът с известните сортове е непълен, включващ може би само 10% от реалния брой съществуващи сортове (Hawksworth 2001; Kirk et al. 2001). Броят на гъбите с известни фармакологични качества е още по-малък. Въпреки всичко сортовете, изследвани досега, представляват голям източник на анти-ракови и имунно-стимулиращи полизахариди. Много, ако не всички гъби Basidiomycetes съдържат биологично активни полизахариди. От 651 сорта и 7 инфраспецифични таксони от 182 вида higher Hetero- и Homobasidiomycetes, огромно мнозинство съдържат фармакологично активни полизахариди в плодни си тела, култивирани мицели или култивиран бульон (Reshetnikov et al. 2001). Гъбните полизахариди имат различен химичен състав, предимно принадлежащи към групата на β-глюкани (Mizuno 1999a, 2000). Анти-туморните полизахариди от различни гъби са обособени според техните молекулни тегла, степен на разклоняване и по-висока (третична) структура. Очевидно е, че такива структурни характеристики като β-(1→3) връзки в основната верига на глюкан и допълнителни β-(1→6) разклонени точки са необходими за анти-туморното действие. β-глюканите, съдържащи предимно (1→6) връзки, имат по-слабо действие. Глюканите с високо молекулно тегло изглежда са по-ефективни от тези с ниско молекулно тегло (Mizuno 1996, 1999a, b). За разлика от β-(1→3)-глюкани, α-(1→3)-glucuronoxylomannans, които са характерни за желираните гъби, не зависят много от молекулното тегло. Съществуват различни подходи за подобряване анти-туморното действие на гъбните полизахариди чрез химична модификация, която е необходима и за подобряване на техните клинични качества, разтворимост във вода и възможност за проникване през стомашните стени след орално поглъщане. Двете основни процедури за химично подобряване са: модификация на гъбните полизахариди чрез разграждане на Смит (oxydo-reductohydrolysis) и активиране чрез метода на формолиза. Най-успешните схеми за такива методи са били разработени за Ganoderma lucidum, Grifola frondosa и Leucopaxillus giganteus (= Tricholoma gigantea). Карбоксиметилация е друг химичен метод, който трансформира β-глюкани във водоразтворима форма. Голям брой експериментални и клинични данни показват полезните резултати на гъбните полизахариди за следните цели: (1) предпазване от онкогенезис чрез орално консумиране на гъби или техните препарати; (2) пряко анти-туморно действие срещу различни алогенни и сингенни тумори; (3) имунно-засилващо действие срещу тумори заедно с химиотерапия; (4) превантивни ефекти върху туморни метастази. Повечето от клиничните данни идват от търговските полизахариди лентинан, PSK (krestin), и schizophyllan, но съществуват също забележителни нови данни за полизахариди от Phellinus linteus, Flammulina velutipes, Hypsizygus marmoreus, A. blazei и други. Биохимичните механизми, които пренасят биологичното действие на полизахаридите, са все още недостатъчно изучени. Полизахаридите от гъби не атакуват раковите клетки пряко, а произвеждат техни анти-туморни ефекти чрез активиране на различни имунни отговори в приемника. Анти-туморното действие на полизахаридите изисква непокътнат компонент на Т-клетки; тяхното действие се пренася чрез имунен механизъм, зависещ от тимуса (Borchers et al. 1999). Гъбните полизахариди са известни като стимулиращи естествените клетки убийци, Т-клетки, В-клетки и макрофаг-зависещи отговори на имунната система. Имунно-модулиращото действие на гъбните полизахариди е особено ценно като средство за профилактика, лека и неагресивна форма на третиране, предпазване от метастазни тумори и като лечение заедно с химиотерапия. Сред higher Basidiomycetes гъби са открити много биологично активни полизахариди, а тяхното практическо приложение зависи не само от уникалните им свойства, а и от биотехнологичната наличност. Изолацията и пречистването на полизахариди от гъбен материал са сравнително лесни и ясни, и могат да се извършват с минимални усилия (Mizuno 1996, 1999a). Мицелите, формирани от отглеждане на чисти култури в потопени условия, са с постоянен състав, а потопената култура е най-добрата техника за получаване на правилни и безопасни гъбни продукти (Wasser et al. 2000; Reshetnikov et al. 2001).

Приложение 1

Приложение 2

Фигура 1

Фракционно приготвяне на полизахариди от гъби (адаптирано от Mizuno (1999a) с модификация)

Фигура 2

Възможни пътища на действие на Лентинан (според Chihara 1981)

Фигура 3

Възможен имунен механизъм: β-D-глюкан модификатор на биологичен отговор (МБО; BRM) (според Mizuno 2002)